豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型PCR程序優(yōu)化及分子鑒定

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；2.河南省滑縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南滑縣456400）

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002；2.河南省滑縣動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南滑縣456400）

豬接觸性傳染性胸膜肺炎（porcine contagious pleuropneumonia，PCP）又稱壞死性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放線桿菌引起的一種高度接觸傳染性、致死性呼吸道傳染病。以急性出血性纖維素性肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜炎為主要特征。各種年齡、性別的豬對(duì)本病均易感，急性者死亡率高，慢性者常能耐過(guò)。豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌有15個(gè)血清型，不同血清型之間沒(méi)有或僅有較弱的交叉保護(hù)作用，這給豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的診斷防治和免疫預(yù)防帶來(lái)了很大的困難。因此建立一種快速血清型分子鑒定方法尤為重要。為了快速、簡(jiǎn)便的建立豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清型分子鑒定的方法，本研究所從臨床發(fā)病疑似病例豬肺臟和氣管中分離到的放線桿菌，首先經(jīng)過(guò)血清型鑒定，確定部分血清型為2型，為了確定血清型鑒定的準(zhǔn)確性，在此基礎(chǔ)上，采用分子鑒定的方法，對(duì)這些菌株進(jìn)行鑒定，確定分離到的11株菌為豬胸膜肺炎放線桿菌血清2型。這為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清型分子鑒定及防治提供了理論依據(jù)，為今后臨床血清型定型提供了一種簡(jiǎn)便方法。

豬胸膜肺炎放線桿菌；分子鑒定；血清2型

PCP又稱壞死性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的一種急性呼吸道傳染病，以急性出血性纖維素性肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜炎為特征的呼吸道疾病[1-3]。該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，常呈地方性流行，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。APP血清型較多，并且各個(gè)血清型之間沒(méi)有或僅有較弱的交叉保護(hù)作用，這給APP的防治和免疫預(yù)防帶來(lái)很大的困難。目前PCP已成為豬臨床發(fā)病中最為嚴(yán)重的疾病之一，該病已成為豬傳染病研究中的熱點(diǎn)之一。

目前已報(bào)道的APP有15個(gè)血清型，15個(gè)血清型又分為生物Ⅰ型和生物Ⅱ型[4-6]。生物Ⅰ型包括血清型1～12型和15型，生物Ⅱ型的生長(zhǎng)包括血清型13和14。其中血清型1和5型又可分為A和B兩個(gè)亞型，即血清型1A、1B和5A、5B[7-9]。各種年齡的豬均可感染，病豬、耐過(guò)豬和帶菌豬是本病暴發(fā)和流行的潛在傳染源，無(wú)臨診癥狀有病理變化豬，或無(wú)臨診癥狀無(wú)病理變化陰性帶菌豬較常見(jiàn)，給本病的控制和凈化根除帶來(lái)困難[10-12]。對(duì)現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的危害較大，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，成為影響現(xiàn)代化養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要呼吸系統(tǒng)疾病。

圖1 臨床胸膜肺炎放線桿菌肺臟和氣管病例Fig.1 Clinical cases of Porcine contagious pleuropneumoniaActinobacillus pleuropneumoniaelung and tracheal

APP血清型較為復(fù)雜，并且各個(gè)血清型之間沒(méi)有或有較弱的交叉反應(yīng)，市場(chǎng)沒(méi)有一種疫苗可以預(yù)防所有APP的發(fā)生，所以摸清各個(gè)地方和地區(qū)的流行血清型，采用含有本血清型的疫苗才能取得較好的效果。本研究為了建立一種簡(jiǎn)便快速的血清定型方法，從臨床疑似病例豬肺臟和氣管（見(jiàn)圖1）中分離到的APP進(jìn)行血清型分子鑒定，確定分離到得11株菌為APP血清2型。該研究為豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的臨床診斷和治療及疫苗預(yù)防和血清型分子鑒定提供了理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料NAD（煙酰胺嘌呤二核苷酸）購(gòu)于大連寶生物工程有限公司，APP 1型至12型陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。95%乙醇、無(wú)水乙醇等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、普通血清肉湯培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）、巧克力培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂（含10%犢牛血清和100 μg/mL NAD）。

1.2 方法

1.2.1 APP真空冷凍干燥菌株的恢復(fù)培養(yǎng)把菌株從-80℃的冰箱中取出，用75%的酒精脫脂棉球擦凈安培瓶，用火焰加熱器頂端，滴少量無(wú)菌水使之破裂，用無(wú)菌鑷子敲下已破裂的頂端。接種于腦心浸液瓊脂（含10%犢牛血清和100 μg/mL NAD）平板上，置于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，提取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)菌血清型鑒定取純培養(yǎng)的細(xì)菌，制備適宜濃度的細(xì)菌液，與不同血清型APP標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，觀察凝集現(xiàn)象，確定分離菌的血清型。

1.2.3 PCR分子鑒定

1.2.3.1 APP基因組提取及模板制備將胸膜肺炎放線桿菌接種于腦心浸液瓊脂（含10%犢牛血清和100 μg/mL NAD）平板上，置于體積分?jǐn)?shù)為10%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按細(xì)菌基因組提取試劑盒（LifeFeng Cat#DK622-01）進(jìn)行DNA的提取。

1.2.3.2 PCR引物設(shè)計(jì)根據(jù)Genbank已發(fā)表的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌基因序列，從編碼莢膜多糖的堿基序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物。

上游引物5′-ACTATGGCAATCAGTCGATTCAT-3′

下游引物3′-CCTAATCGGAAACGCCATTCTG-5′

預(yù)期擴(kuò)增片段為500 bp，引物由上海生工生物工程有限公司，用超純凈水稀釋為25 pmol/ μL，備用。

1.2.3.3 PCR反應(yīng)條件及擴(kuò)增程序以上述DNA為模板，按以下體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：總體積為50.0 μL，超純水37.0 μL，10×Buffer（Mg2+）5.0 μL，dNTPs，4.0 μL（2.5 mmol/μL），正向引物2 μL（25 pmol/μL），反向引物2 μL（25 pmol/ μL），Taq enzyme，0.5 μL（5 U/μL），模板DNA，0.5 μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，72℃最后擴(kuò)展10 min。

1.2.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物和2 μL Loading Buffer混勻，加到含EB的1.5%的瓊脂糖凝膠中，同時(shí)加入對(duì)照和DNA Marker（DL 2 000），電壓為120 V，電泳1 h左右。

1.2.3.5 PCR產(chǎn)物的回收PCR擴(kuò)增得到的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，在紫外燈照射下，按DNA回收試劑盒的方法，在紫外燈照射下從瓊脂糖凝膠中切取特異性條帶，切取條帶時(shí)，盡量去掉多余的瓊脂糖凝膠，用（UNIQ-10）柱式DNA膠回收試劑盒回收胸膜肺炎放線桿菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收方法參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)（Cat#SK1131）。

1.2.3.6 PCR產(chǎn)物的連接將回收的PCR產(chǎn)物分別與pUCm-T載體按T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒方法連接。

①在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的10 μL連接反應(yīng)體系中，加入50 ng pUCm-T載體、0.2 pmol的回收PCR片段、1 μL 10×ligation Buffer和1 μL的T4 DNAligase，其余用水補(bǔ)足。

②反應(yīng)體系：10×ligation Buffer 1 μL，50%PEG 1 μL，pUCm-T載體1 μL，回收PCR片段3 μL，無(wú)菌水3 μL，T4 DNA Ligase 1 μL，總體積10 μL。

③16～23℃連接1 h，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.7 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備應(yīng)用一步法制備高效感受態(tài)細(xì)胞試劑盒方法操作，詳細(xì)步驟如下。

①取1 mL A600nm約0.5～0.6的菌到1.5 mL的微量離心管中。

②4000 r/min離心4～5 min，徹底去除上清，再加0.1 mL的預(yù)冷的SSCS溶液輕輕懸浮菌體。

③加入100 pg～10 ng用于轉(zhuǎn)化DNA。

④混勻DNA和細(xì)胞且在冰上放置30 min，然后在42℃放置90 s，再在冰上放置15～20 min。

⑤加0.8 mL的LB培養(yǎng)基到離心管中，而后在37℃、200 r/min下培養(yǎng)1 h。

⑥將細(xì)胞涂布于相應(yīng)抗性的平板上。

1.2.3.8 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化將上一步連接后的DNA產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化步驟如下。

①取100 μL感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上，完全解凍后輕輕將細(xì)胞均勻懸浮。

②加入10 μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻。冰上放置30 min。

③42℃水浴熱激90 s。冰上放置15～20 min。

④加400 μL LB培養(yǎng)基，37℃200～250 r/ min震蕩培養(yǎng)1 h。

⑤用槍頭吸取200 μL培養(yǎng)菌液，涂布在預(yù)先用20 μL 100 mmol IPTG和100 μL 20 mg/mL X-gal涂布的氨芐青霉素平板上。

⑥平板在37℃下正向放置1 h以吸收過(guò)多的液體，然后倒置培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.3.9 藍(lán)白斑篩選當(dāng)外源DNA片段插入到pUC57中后，由于外源DNA的核酸序列存在改變了LacZ基因的編碼，從而影響了其產(chǎn)物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，因此重組克隆在X-gal/ IPTG平板上呈現(xiàn)為白色，而非重組克隆呈藍(lán)色，選擇在IPTG/X-gal平板上生長(zhǎng)的白色菌落，用槍頭挑至含氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。

1.2.3.10 質(zhì)粒DNA的提取按照質(zhì)粒DNA提取試劑盒進(jìn)行操作，其具體步驟如下。

①將過(guò)夜培養(yǎng)的1～2 mL細(xì)菌12 000 r/min離心15 s，徹底去除上清。

②加入250 μL SolutionⅠ，用槍頭活振蕩器充分懸浮細(xì)菌。

③加入250 μL SolutionⅡ，立即溫和混勻（傾斜45度角，順一個(gè)方向，慢慢旋轉(zhuǎn)離心管），使細(xì)菌裂解，室溫放置2 min。

④加入350 μL SolutionⅢ，立即上下顛倒5～10次，使之充分中和，室溫放置5 min。

⑤12 000 r/min，離心10 min。

⑥將步驟5中上清液轉(zhuǎn)移到套放于2.0 mL收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，室溫放置2 min，8 000 r/ min室溫離心30 s。

⑦棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一支收集管中，吸取500 μL Wash Solution到UNIQ-10柱，10 000 r/min室溫離心1 min。

⑧重復(fù)步驟7。

⑨棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一支收集管中，12 000 r/min室溫離心2 min，以徹底去除Wash Solution。

⑩將UNIQ-10柱放入新的潔凈1.5 mL離心管中，加50 μL l Elution Buffer，室溫放置2 min后，10 000 r/min室溫離心1 min。離心管中的溶液即為所抽提的質(zhì)粒DNA。

1.2.3.11 質(zhì)粒DNA的酶切鑒定將上一步所提質(zhì)粒各取5 μL于0.75%的瓊脂糖凝膠中120 V電泳1 h，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄結(jié)果，挑取DNA條帶相對(duì)滯后的質(zhì)粒DNA進(jìn)行ECORⅠ和PSTⅠ雙酶切。

酶切體系如下：總體積20.0 μL，質(zhì)粒DNA 5.0 μL，ddH2O 11.0 μL，10×H Buffer 2.0 μL，PSTⅠ1.0 μL，ECORⅠ1.0 μL?；靹蚝?，稍微離心，37℃酶切2 h。然后于0.75%的瓊脂糖凝膠中120 V電泳45 min，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并記錄結(jié)果。

1.2.3.12 陽(yáng)性克隆序列測(cè)定將上一步酶切鑒定的陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒，送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。用Applied Biosystems（3730XL）測(cè)序儀測(cè)序儀。所得序列于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)據(jù)比對(duì)與傳染性胸膜肺炎放線桿菌2型的同源性達(dá)99%以上。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌血清型菌株的純培養(yǎng)物分別與1型～12型APP標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離到的11株菌均與標(biāo)準(zhǔn)Ⅲ型陽(yáng)性血清呈現(xiàn)明顯的凝集現(xiàn)象，與其他標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和生理鹽水對(duì)照均不發(fā)生凝集反應(yīng)。凝集試驗(yàn)結(jié)果表明分離到的11株菌均為胸膜肺炎放線桿菌血清2型。

圖2 豬胸膜肺炎放線桿菌PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 The PCR results of Actinobacillus pleuropneumoniae

2.2 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)、克隆及測(cè)序PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，然后在凝膠成像儀中觀察，見(jiàn)圖2。

從圖2可以看出，以APP為模板，均能擴(kuò)增出與預(yù)期一致的一條500 bp核酸片段，而豬肺炎支原體沒(méi)有擴(kuò)增出該片段。

所得PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，與GenBank已發(fā)表的胸膜肺炎放線桿菌血清型2型的同源性達(dá)99%以上。

3 討論

豬傳染性胸膜肺炎在世界各國(guó)流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[13]。胸膜肺炎放線桿菌血清型較多，不同國(guó)家和地區(qū)流行的血清型不同。在墨西哥，1a，3,5a，5b和7血清型[14]，許多歐洲國(guó)家主要是2、9血清型，北美主要是1、5血清型[15,16]，加拿大和美國(guó)主要是1、5、7血清型，德國(guó)主要是2、7、9血清型[17]，英國(guó)主要是3和8血清型[18]，澳洲主要為1、7、12血清型，日本主要為2、5血清型，韓國(guó)主要為2、4、5、7血清型，我國(guó)主要是1、2、3、4、5、7、8、9、10血清型[19-20]。本試驗(yàn)臨床病例中分離胸膜肺炎放線桿菌，并以標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，采用平板凝集試驗(yàn)對(duì)11株APP分離菌進(jìn)行了血清型鑒定，并采用PCR方法對(duì)血清型2型的分子鑒定進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果這11株菌均為血清2型，這為該豬場(chǎng)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的預(yù)防控制和免疫防控提供了重要的依據(jù)。

豬傳染性胸膜肺炎是規(guī)模化豬場(chǎng)中主要的呼吸系統(tǒng)疾病之一。同時(shí)，引起豬群發(fā)生呼吸道癥狀的疫病還有豬支原體肺炎、豬傳染性萎縮性鼻炎、副豬嗜血桿菌病等。目前，抗生素是治療細(xì)菌性疾病的關(guān)鍵，由于臨床用藥的不規(guī)范及濫用藥物導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加，以及導(dǎo)致疾病對(duì)動(dòng)物機(jī)體的損傷無(wú)法用藥物來(lái)恢復(fù)等，導(dǎo)致抗生素在治療細(xì)菌性疾病上沒(méi)有明顯效果。臨床分離出大量多重耐藥菌株，抗生素的應(yīng)用已經(jīng)很難達(dá)到控制本病的發(fā)生。因此開(kāi)展血清型鑒定、細(xì)菌耐藥性、流行病學(xué)和疫苗的研究具有重大意義。

胸膜肺炎放線桿菌血清型比較復(fù)雜，具有地方特異性，同時(shí)各血清型之間也很難產(chǎn)生較強(qiáng)的交叉保護(hù)作用。感染本病后往往容易出現(xiàn)繼發(fā)感染，增加了防控的難度。另外，感染過(guò)本病且耐過(guò)的豬成為潛在的傳染源。因此，及時(shí)、準(zhǔn)確地分離鑒定APP，研制新型獸藥制劑及新型疫苗，對(duì)防控本病具有重要的指導(dǎo)意義。

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（編輯：郭雪峰）

豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型PCR程序優(yōu)化及分子鑒定

李海利1，朗利敏1，徐引弟1，焦文強(qiáng)1，朱文豪1，張立憲1，張青嫻1，游一1，候自花1，楊素新2，許峰1，鄭萬(wàn)錄1，王克領(lǐng)1?

PCR program optimization and molecular identification of Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2

Li Haili1,Lang Limin1,Xu Yindi1,Jiao Wenqiang1,Zhu Wenhao1, Zhang Lixian1,Zhang Qingxian1,You Yi1,Hou Zihua1,Yang Suxin2, Xu Feng1,Zheng Wanlu1,Wang Keling1*

（1.Animal Husbandry and Veterinary Research Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences,Henan Zhengzhou450002; 2.Animal Health Supervision Institute of Huaxian,HenanHuaxian456400）

Porcine contagious pleuropneumonia also known as necrotic pleuropneumonia,is a highly contagious and lethal respiratory infectious disease caused by Actinobacillus pleuropneumoniae. The main characteristic of this disease are acute hemorrhagic fibrinous pneumonia and chronic fibrinous necrosis.Pigs at all ages and gender were susceptible to this disease and caused acute mortality.Actinobacillus pleuropneumoniae has 15 serotypes,there are no or weakly cross protection between different serotypes,which brought great difficulties to control,diagnosis and im-mune prevention this disease.So it is particularly important to establish a rapid molecular identification method for serotype.In order to establish a rapid,simple method to identify Porcine Contagious pleuropneumoniae serotype,this research identified Actinobacillus pleuropneumoniae from swine lung and trachea with clinical of suspection,through serotype identification,determined type 2 serotype.In order to determine the accuraate serotype,the method of molecular identification was studied.11 isolated strains were identified as serotype 2 Actinobacillus pleuropneumoniae.This provides a theoretical basis for molecular identification the infectious porcine Actinobacillus pleuropneumoniae serotype,and provides a simple method for the future clinical serum identification.

Porcine contagious pleuropneumoniaActinobacillus pleuropneumoniae;Molecular identification;Serotype 2

S852.619文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1672-9692(2015)01-0033-07

2014-12-25

李海利（1982-），男，博士，助理研究員，主要從事動(dòng)物傳染病臨床診斷及防控研究工作。

王克領(lǐng)（1964-），男，本科，副研究員，主要從事獸醫(yī)傳染病防控研究工作。

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院優(yōu)秀青年科技基金（2013YQ22）

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