兩種糞腸球菌的分離方法比較

（1.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧沈陽110016；2.遼寧成大生物股份有限公司，遼寧沈陽110179）

（1.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，遼寧沈陽110016；2.遼寧成大生物股份有限公司，遼寧沈陽110179）

本研究利用采集的雞泄殖腔和豬肛門拭子樣本400份，采用兩種方法分離糞腸球菌并進行對比。結(jié)果顯示，兩種方法對4類樣品中糞腸球菌的分離率分別為22%、33%、23%、22%（方法Ⅰ）和86%、91%、87%、82%（方法Ⅱ），說明建立了準(zhǔn)確、高效、可靠的糞腸球菌分離方法。

糞腸球菌；分離純化；方法比較

腸球菌屬于1984年從鏈球菌屬中分離出來成為獨立的新菌屬[1-2]，現(xiàn)根據(jù)DNA同源性，將其列為腸球菌屬，屬腸（見獸醫(yī)微生物學(xué)第五版第90頁）球菌科。腸球菌在自然界分布廣泛，是水、空氣、塵埃、人及動物糞便以及健康上呼吸道的常在菌，糞腸球菌和屎腸球菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染的主要腸球菌種[3]，已經(jīng)成為醫(yī)院內(nèi)感染的第二大病原[4-6]，但在動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對該病原的研究很少[7-9]。美國食品藥品監(jiān)察管理局（FDA）、疾病預(yù)防控制中心（CDC）和美國農(nóng)業(yè)部（USDA）共同組成一個全國性的監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，監(jiān)測選定的動物腸道病原菌和動物、零售肉類和人的共生生物對在人醫(yī)和獸醫(yī)中有重要意義的抗菌素的耐藥性的變化情況[10]，該部門從2003年開始監(jiān)測糞腸球菌的耐藥變化情況。我國獸醫(yī)系統(tǒng)也建立了全國動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)，建設(shè)了國家獸藥安全評價實驗室體系[11]，2013年起把糞腸球菌作為重點監(jiān)測目標(biāo)菌株。本文通過比較傳統(tǒng)方法與本實驗室自建的分離鑒定方法，對動物源糞腸球菌進行分離和鑒定，摸索出適合實際工作應(yīng)用的糞腸球菌的一套快速、準(zhǔn)確、可靠的分離鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 菌株及待分離材料來源質(zhì)控菌株為ATCC29212，購自中國獸藥監(jiān)察所；待分離材料采自養(yǎng)殖場（戶）。

1.2 儀器生物安全柜CLASSⅡ（美國NUAIRE公司）；全自動高壓滅菌器（日本三洋電器集團）；ABT Expression鑒定儀（BIOMERIEUX公司）。

1.3 培養(yǎng)基與材料運送培養(yǎng)基、腸球菌顯色培養(yǎng)基、腸球菌肉湯培養(yǎng)基、哥倫比亞血瓊脂、革蘭氏染色液購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；API NaCl 0.85%培養(yǎng)基、ID32E鑒定條均購自BIOMERIEUX公司。

1.4 方法

1.4.1 采樣用滅菌棉簽采集動物肛門和泄殖腔樣品，置于運送培養(yǎng)基中0～4℃保存。

1.4.2 分離純化方法Ⅰ取拭子樣品直接接種于糞腸球菌瓊脂平面，36±1℃培養(yǎng)48 h。挑取糞腸球菌可疑菌落，接種于腸球菌顯色培養(yǎng)基36±1℃培養(yǎng)48 h。將疑似菌株接種于哥倫比亞血瓊脂上36± 1℃培養(yǎng)24 h，備用。

1.4.3 分離純化方法Ⅱ?qū)⑹米訕悠分苯臃湃肽c球菌肉湯中，36±1℃培養(yǎng)24 h。挑取預(yù)增菌培養(yǎng)物劃線接種于糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基36±1℃培養(yǎng)48 h。將疑似菌株接種于哥倫比亞血瓊脂上36± 1℃培養(yǎng)24 h，備用。

1.4.4 形態(tài)學(xué)鑒定挑取肉湯培養(yǎng)物及平板上單菌落分別作革蘭氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)和染色特征。

1.4.5 生化鑒定將上述獲得的疑似單菌落，在哥倫比亞血瓊脂平板上劃線純化培養(yǎng)不超過24 h。將待檢細(xì)菌單個菌落，懸浮于3 mL懸浮培養(yǎng)基，制備4.0麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，使用自動加樣器將菌懸液滴入試紙條反應(yīng)杯中，每個反應(yīng)杯中滴入55 μL，菌液和試劑滴加完畢后，37℃培養(yǎng)4 h，用細(xì)菌鑒定儀判讀。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基上帶棕色環(huán)的棕黑色菌落，邊緣光滑無白色潤圈的為疑似單菌落，白色菌落為其他菌株，結(jié)果見圖1～圖2。

圖1 陽性糞腸球菌在糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基上的生長形態(tài)Fig.1 Positive Enterococcus faecalis growth morphology on Enterococcus faecalis agar medium

圖2 陰性對照菌株在糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基上的生長形態(tài)Fig.2 Negative control strains growth morphology on Enterococcus faecalis agar medium

挑取疑似菌株接種于腸球菌顯色培養(yǎng)基培養(yǎng)，紅色至紫紅色的可疑菌落可進一步確定為糞腸球菌，結(jié)果見圖3。

圖3 糞腸球菌在腸球菌顯色培養(yǎng)基上生長狀態(tài)Fig.3 Enterococcus faecalis growth morphology on Enterococcus chromogenic medium

在腸球菌肉湯中，培養(yǎng)后混濁變黑為疑似糞腸球菌；仍保持澄清透明、棕褐色為陰性，具體結(jié)果見圖4。

圖4 腸球菌肉湯中的生長情況Fig.4 Enterococcus broth growth situation

最終在哥倫比亞血瓊脂上菌落圓形、純白色，表面凸起濕潤、有光澤、邊緣整齊的菌落確定為陽性糞腸球菌，結(jié)果見圖5。

圖5 糞腸球菌在哥倫比亞血瓊脂上的生長狀態(tài)Fig.5 Enterococcus faecalis growth morphology on Columbia blood agar medium

2.2 鑒定結(jié)果檢測菌株均為革蘭氏陽性菌，細(xì)菌呈現(xiàn)圓形或卵圓形，在固體培養(yǎng)基上單個、成對或呈鏈狀排列，鏈的長短不一、形狀各異。兩種分離純化方法得到的疑似菌株經(jīng)細(xì)菌鑒定儀判讀后得到的陽性糞腸球菌生化鑒定結(jié)果，見表1。

表1 糞腸球菌生化鑒定檢驗報告單Table1 Enterococcus faecalis biochemical identification inspection report

2.3 兩種方法分離率比較通過以上兩種試驗方法的比較，發(fā)現(xiàn)方法Ⅱ的分離率在80%以上，在不同物種不同養(yǎng)殖場分離率都高于方法Ⅰ，具體數(shù)據(jù)見表2～表3，該方法實用性強，便于推廣使用。

表2 兩種糞腸球菌分離方法比較Table2 Comparison of two kinds of Enterococcus faecalis separation method

表3 兩種分離鑒定糞腸球菌方法比較Table3 Comparison of two kinds of Enterococcus faecalis isolation and identification method

3 討論

本實驗室建立的分離純化方法Ⅱ，經(jīng)過3步的分離純化，糞腸球菌的分離率可達80%～90%，用生化鑒定證明了該方法的陽性率高達98%以上，在實際應(yīng)用中可省略生化鑒定步驟，作為高效的糞腸球菌篩選方法；而傳統(tǒng)的分離純化方法Ⅰ只有通過生化鑒定最終才能確定是否是陽性菌株，分離效果難以掌控。比較方法Ⅰ和方法Ⅱ詳見表3。因此，方法Ⅱ更適用于實際糞腸球菌的分離鑒定。

比較兩種方法區(qū)別主要是在第一步使用的培養(yǎng)基不同，分別是糞腸球菌瓊脂和腸球菌肉湯。糞腸球菌瓊脂使用的是平板，腸球菌肉湯使用的是液體培養(yǎng)基，棉簽浸浴在肉湯中更利于糞腸球菌的增殖。糞腸球菌瓊脂培養(yǎng)基中的月示胨和酵母浸粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源；乳糖是大腸菌群可發(fā)酵的糖類；疊氮化鈉可抑制革蘭陰性菌；溴甲酚紫和TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）作為指示劑；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。腸球菌肉湯培養(yǎng)基中的胰酪蛋白胨和牛肉浸粉、酵母粉提供氮源、維生素和生長因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；細(xì)菌水解七葉苷與檸檬酸鐵銨中鐵離子反應(yīng)形成黑色的6,7-二羥基香豆素；檸檬酸鈉、牛膽粉和疊氮化鈉為選擇性抑菌劑，抑制非鏈球菌的細(xì)菌。根據(jù)兩種培養(yǎng)基的成分和相應(yīng)的作用，方法Ⅱ中使用的的抑制非鏈球菌的抑制劑較方法Ⅰ多，從多種途徑抑制雜菌的生長，從而達到了良好的分離效果。

[1]齊亞銀，剡根強，王靜梅，等.致羔羊腦炎型糞腸球菌的分離鑒定[J].石河子大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2005，23（2）：200-202.

[2]季尚寧，肖玉珍.土壤滅菌對連作大豆生長發(fā)育的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1996，27（4）：326-329.

[3]李光輝.腸球菌感染研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)：內(nèi)科學(xué)分冊，1999，26（11）：471-474.

[4]王豫平，王慕云.腸球菌耐藥性研究及對策[J].廣西醫(yī)學(xué)，2002，24（1）：59-61.

[5]Moellering Jr R C.Emergence of Enterococcus as a significant pathogen[J].Clinical Infectious Diseases,1992:1173-1176.

[6]杜蓉，馮萍.腸球菌的耐藥機制研究進展[J].華西醫(yī)學(xué)，2006，21（2）：395-396.

[7]蘇葳藝，李欣南，韓鐫竹.某養(yǎng)殖場雞源糞腸球菌分離鑒定及耐藥性研究[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2014，4：48-50.

[8]薛青紅，劉燕，杜昕波.豬源糞腸球菌的BIOLOG系統(tǒng)鑒定及其生物學(xué)特性[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2006，36（11）：876-879.

[9]王亞賓，張紅英，陳麗穎，等.臨床感染豬腸球菌菌株的分離與鑒定[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，42（5）：528-531.

[10]Gilbert J M,White D G,McDermott P F.The US national antimicrobial resistance monitoring system[J].Future Medicine,2007:493-500.

[11]趙曉彤，周鐵忠，李欣南.我國動物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)測現(xiàn)狀與耐藥性控制策略分析[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2013，12：45-48.

（編輯：張婷婷）

兩種糞腸球菌的分離方法比較

韓鐫竹1，李欣南1?，蘇葳藝1，楊文腰2

The comparison between two methods to separation and purification of enterococcus faecalis

Han Juanzhu1,Li Xinnan1*,Su Weiyi1,Yang Wenyao2

(1.Liaoning Testing&Inspection Center for Quality&Safety of Veterinary Drugs,Feed and Livestock Products, LiaoningShenyang110016; 2.Liaoning Chengda Company Limited,LiaoningShenyang110179)

400 swab samples collected from chicken cloaca and pig anus were used to compare two methods to separation and purification of enterococcus faecalis.The separation rates of the two methods were 22%、33%、23%、22%(MethodⅠ)and 86%、91%、87%、82%(MethodⅡ).Thus the accurate,fast and reliable method of separation wasestablished.

Enterococcus;Separation and purification;Method comparison

S858.23文獻標(biāo)識碼：B文章編號：1672-9692(2015)01-0005-05

2014-11-25

韓鐫竹（1985-），女，碩士研究生，主要從事動物源細(xì)菌耐藥方面工作。

李欣南（1978-），女，博士，主要從事動物源細(xì)菌耐藥性、微生態(tài)制劑、生鮮乳質(zhì)量安全評價等方面工作。

948課題“獸藥監(jiān)管技術(shù)引進”項目編號2011-G14（4）