豹源貓杯狀病毒ORF2基因的擴(kuò)增、克隆及原核表達(dá)

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林長春130118）

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，吉林長春130118）

為制備貓杯狀病毒血清學(xué)檢測抗原，本研究根據(jù)實驗室保存的1株豹源貓杯狀病毒基因序列設(shè)計引物，擴(kuò)增了開放閱讀框2（ORF2）中1 734 bp的核苷酸序列，將其克隆至表達(dá)載體pET-28a上，構(gòu)建了pET-28a-FCV1734重組質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot檢測，證明所表達(dá)的蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

貓杯狀病毒；ORF2基因；表達(dá)

貓杯狀病毒（Feline calicivirus，F(xiàn)CV）是引起貓及貓科動物口腔和上呼吸道感染的病原，單獨感染常不會引起嚴(yán)重的疾病，和其他病原發(fā)生混合感染可加重病情[1]。輕者出現(xiàn)口腔潰瘍、牙周炎、結(jié)膜炎等癥狀，重者引發(fā)肺炎、腸胃炎和跛行等。該病毒最早在1957年被分離得到，全基因序列由Carter M J等測定[2]。FCV引發(fā)的貓傳染性鼻-結(jié)膜炎呈世界性分布，所有的貓科動物都易感，也有感染狗的報道[3]。近年來，出現(xiàn)了高致死性變異強毒株[4]，在意大利[5]、法國[6]和英國[7]已有報道。

FCV呈二十面體對稱，無囊膜，病毒粒子直徑為30～39 nm。衣殼蛋白由32個暗色的中空杯狀殼粒構(gòu)成。病毒核酸為單股正鏈RNA，基因組全長約7.8 kb，有3個開放閱讀框（ORF）。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白。ORF2編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1，分為6個區(qū)域（A～F），其中C、D、E含有多抗原位點，C和E為可變區(qū)域。ORF2先合成75 kDa的前體衣殼蛋白，后經(jīng)蛋白酶加工切除后，形成62 kDa的衣殼蛋白[8]。ORF3編碼大小約為12 kDa的結(jié)構(gòu)蛋白VP2。不同F(xiàn)CV毒株之間ORF2可變區(qū)的差異較大，各毒株間同源性在57%～79%[9]。

本研究根據(jù)實驗室保存的1株豹源貓杯狀病毒ORF2比較保守的區(qū)域設(shè)計了1對引物，擴(kuò)增獲得了1 734個核苷酸序列，克隆至表達(dá)載體pET-28a上，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌進(jìn)行了表達(dá)，并以Western blot檢測了重組蛋白的反應(yīng)原性，為該病毒血清檢測抗原的制備奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒大腸埃希菌DH5α工程菌、Bl21（DE3）工程菌購自北京全式金公司；質(zhì)粒pET-28a和含有豹源FCV ORF2基因的質(zhì)粒均為本實驗室保存和構(gòu)建。

1.1.2 主要試劑ExTaq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I購自TaKaRa公司；貓杯狀病毒抗體由本實驗室自制，HRP標(biāo)記的y羊抗貓二抗購自美國BETHYL公司；Protein Marker質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，瓊脂糖凝膠購自西班牙BIOWEST公司，瓊脂糖電泳回收試劑盒購自AXYGEN公司，Proten Marker購自北京全式金公司；DAB顯色試劑盒購自北京中杉橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計及合成根據(jù)本實驗室已經(jīng)完成全基因序列測定的豹源FCV的ORF2序列設(shè)計引物，選擇的酶切位點為EocR I/Xho I，擴(kuò)增目的片段長度為1 734 bp。上游引物序列：CCGGAATTCCGGATGTGCTCAACCTGCGCTAA；下游引物序列：CCGCTCGAGGTTAATGACATAGCCCAATTTTAGTGTG。引物送往生工生物工程上海股份有限公司合成。

1.2.2 目的基因片段的擴(kuò)增以本實驗室保存的含有豹源FCV ORF2的質(zhì)粒為模版，用高保真ExTaq DNA聚合酶進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為：模板2 μL、dNTPs 2 μL，PCR緩沖液2.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ExTaq DNA聚合酶0.3 μL，雙蒸餾水17.2 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min， 94℃變性30 s，退火溫度60℃30 s，72℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)，72℃最終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.3 目的基因片段和質(zhì)粒的酶切及回收將擴(kuò)增的目的片段回收后，利用EocR I和Xho I分別進(jìn)行單酶切，再對pET-28a質(zhì)粒進(jìn)行EocR I和Xho I酶切。酶切體系為：EcoR I酶1 μL，10×H緩沖液1 μL，PCR產(chǎn)物4 μL，水4 μL，37℃作用4 h，小牛腸堿性磷酸酶（CIAP）0.2 μL/管，37℃作用1 h。按照AXYGEN膠回收試劑盒說明書回收酶切產(chǎn)物。

1.2.4 重組質(zhì)粒pET-28a-FCV1734的構(gòu)建及鑒定將經(jīng)酶切的目的片段和pET-28a質(zhì)粒用T4 DNA連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化到DH5α工程菌中，37℃培養(yǎng)過夜；挑取單個菌落，涂布于50 μg/mL卡納霉素的LB培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)，按照OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。以EocR I和Xho I酶切鑒定重組質(zhì)粒，將陽性質(zhì)粒送上海生工生物公司測序。

1.2.5 外源基因的表達(dá)及Western blot分析將含有重組質(zhì)粒pET-28a-FCV1734的大腸桿菌接種于含卡那霉素（50 μg/mL）的液體LB培養(yǎng)基中，37℃180 r/min培養(yǎng)過夜；次日以1%（W/W）的濃度接種相同LB培養(yǎng)基，37℃180 r/min搖菌培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600值達(dá)0.6～0.8時，加入IPTG（終濃度為0.8 mmol/L）在25℃條件下誘導(dǎo)6～8 h；取誘導(dǎo)菌10 000 r/min離心2 min，棄去上清，加入50 mL PBS將菌重懸，10 000 r/min離心2 min，重復(fù)2次。將重組菌在冰浴上超聲破碎7 min，間隔3～5 s；7 000 r/min離心15 min，分別取上清和沉淀加入4倍上樣緩沖液，煮沸后進(jìn)行SDS-PAGE（濃縮膠為5%，分離膠為15%）分析。同時設(shè)pET-28a空載體做對照，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色觀察結(jié)果。常規(guī)方法進(jìn)行電轉(zhuǎn)移，4℃5%脫脂奶粉封閉過夜，TBST洗滌3次，每次5 min；FCV陽性血清37℃60 r/min搖床孵育1 h，同上方法洗滌；HRP標(biāo)記羊抗貓IgG，37℃60 r/min搖床孵育1 h，洗滌同上。中山金橋DAB試劑盒顯色分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 目的基因片段的擴(kuò)增以本實驗室保存的含有豹源FCV ORF2的質(zhì)粒為模版，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，于1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，在1 734 bp處出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的目的條帶。

圖1 PCR結(jié)果Fig.1 The result of PCR

2.2 重組質(zhì)粒pET-28a-FCV1734的構(gòu)建及鑒定將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α工程菌，提取質(zhì)粒后進(jìn)行EcoR I和Xho I雙酶切鑒定，酶切后于1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切，結(jié)果如圖2所示，分別在5 000 bp和1 734 bp出現(xiàn)與預(yù)期大小相同的核苷酸條帶。由此證明，F(xiàn)CV 1734核苷酸片段成功連入pET-28a表達(dá)載體中?；驕y序結(jié)果與已知序列完全一致。

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a-FCV1734的酶切鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pET-28a-FCV1734 by enzyme

2.3 外源基因的表達(dá)及鑒定經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，重組菌超聲破碎，SDS-PAGE電泳結(jié)果如圖3，從圖3中可見，在70 kDa出現(xiàn)的目的蛋白，與預(yù)期蛋白大小相符合。

圖3 SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 The result of SDS-PAGE

以常規(guī)方法進(jìn)行電轉(zhuǎn)、封閉、FCV陽性血清、二抗孵育后，DAB試劑盒顯色結(jié)果如圖5，在70 kDa處有特異性條帶，證明表達(dá)的蛋白能夠與FCV的陽性血清、HRP羊抗貓IgG酶標(biāo)二抗反應(yīng)。由此說明，表達(dá)產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性。

圖4 Western blot結(jié)果Fig.4 The result of Western blot

3 討論

FCV ORF2編碼的衣殼蛋白由A～F 6個區(qū)域構(gòu)成，其中，C、D和E區(qū)含有多個抗原表位，其相對比較保守，且與病毒的進(jìn)化關(guān)系密切[10]。此外，在ORF2基因上存在起始密碼子和終止密碼子，其中的1 734 bp的基因序列中含有ORF2的所有抗原表位，因此，本試驗選擇了該段序列進(jìn)行了擴(kuò)增、克隆、表達(dá)和活性分析以制備FCV血清學(xué)檢測用抗原。

由FCV引起的貓傳染性鼻結(jié)膜炎在臨床癥狀上與由貓皰疹病毒1型引起的貓傳染性鼻氣管炎難以區(qū)別，且常和其他病原混合感染，給該病的臨床診斷帶來困難[11]。因此，建立病原學(xué)和血清鑒別診斷方法有實際意義。Martella V等[12-14]建立了對FCV檢測的普通PCR方法，姜雪等[15]建立了熒光定量PCR檢測方法，均可以用于該病的確診。Robert C.H.Lau等[16]建立了FCV間接ELISA方法，用來評估貓杯狀病毒減毒疫苗的免疫原性；Merial[17]利用間接ELISA方法檢測貓傳染性鼻氣管炎病毒、貓細(xì)小病毒和FCV抗體。目前，國內(nèi)尚無檢測FCV的血清學(xué)商品試劑盒。本研究利用本實驗室分離得到的1株豹源FCV，依據(jù)已知的基因序列設(shè)計了引物，成功克隆到表達(dá)載體pET-28a上，獲得了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-FCV1734并進(jìn)行了原核表達(dá)，表達(dá)的蛋白經(jīng)Western blot檢測表明具有良好的反應(yīng)原性。本試驗結(jié)果為FCV血清學(xué)檢測抗原的制備奠定了基礎(chǔ)。目前，筆者以該重組抗原初步建立了FCV間接ELISA方法，正在開展我國貓傳染性鼻結(jié)膜炎的血清學(xué)調(diào)查研究。

[1]Elizabeth S,Williams,Ian K.Infectious diseases of wild mammals[M].Third edition,Iowa:Iowa state university press,2001,4:280-291.

[2]王祥生，夏咸柱，范泉水，等.虎暴發(fā)錐蟲一起[J].中國獸醫(yī)科技，1999，29（7）：34-35.

[3]Horimoto T,Takeu Y,Iwatsuki-Horimoto K,et al.Analysis of the capsid protein Gene of a Feline-like Calicivirus Isolated from a Dog [J].Vet M icrobiol,2002,84(4):315-322.

[4]Schorr-Evans E M,Poland A,Johnson W E,et al.AnEpizooticofHighlyVirulentFeline Calicivirus Disease in a Hospital Setting in New England[J].J Feline Med Surg,2003,5 (4):217-226.

[5]Battilani Mara,Vaccari Francesca,Carelle Maria Stella,et al.Virulent feline calicivirus disease in a shelter in italy:A case description[J].ResearchinVeterinaryScience, 2013,1:25-28.

[6]Reynolds Brice S,Poulet Hervé,Pingret Jean-Luc,etal.Anosocomialoutbreakoffeline calicivirus associated virulent systemic diseaseinFrance[J].JournalofFelineMedicine&Surgery,2009,11(8):633-644.

[7]Coyne KP,Jones BRD,Kipar A,et al.A lethal outbreakofdiseaseassociatedwithfeline calicivirusinfectionincats[J].VetRec, 2006,158(16):544-550.

[8]謝守玉，張健騑.貓杯狀病毒分子生物學(xué)特征及研究進(jìn)展[J].中國動物傳染病學(xué)報，2010，18（6）：79-83.

[9]高玉偉，夏咸柱，扈榮良，等.獵豹與虎貓杯狀病毒的分離及其超變區(qū)基因比較研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2003，25（3）：179-182.

[10]趙艷麗，董宏偉，陳小慶，等.貓杯狀病毒基因及其抗原多樣性研究進(jìn)展[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2014，36（3）：251-254.

[11]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)[M]（第5版）北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012：470-471.

[12]Martella V,Pratelli A,Gentile M,et al. Analysis of the capsid protein gene of a felinelikecalicivirusisolatedfromadog [J].Vet Microbio,2002,85(4):315-322.

[13]Coyne K.P.,Dawson S.,Radford A.D.,et al. Longtermanalysisoffelinecalicivirus prevalenceandviralsheddingpatternsin naturally infected colonies of domestic cats [J].Vet.Microbiol.2006,118:12-25.

[14]Holst B.S.,Berndtsson L.T.,Englund L.Isolationoffelineherpesvirus-1andfeline calicivirusfromhealthycatsinSwedish breedingcatteries[J].FelineMed.Surg, 2005,7:325-331.

[15]姜雪，高玉偉，胡桂學(xué)，等.貓杯狀病毒熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J].吉林大學(xué)學(xué)報，2013，51（5）：973-977.

[16]Robert C.H.Lau,Alison J.Halliday,Hugh Davies.Evaluation of the immunogenicity of attenuated feline calicivirus vaccines by ELISA [J].Veterinary Microbiology,1992,6:139-146.

[17]Merial.AlternativeEarlyLifeVaccination Programs for Companion Animals[J].Elsevier. 2007,137(11):67-71.

（編輯：張婷婷）

豹源貓杯狀病毒ORF2基因的擴(kuò)增、克隆及原核表達(dá)

劉秋艷，應(yīng)瑛，王一鳴，陳小慶，趙艷麗，胡桂學(xué)?

Amplification,Clone and Prokaryotic Expression of ORF2 Gene of Feline Calicivirus Isolated from Leopard

Liu Qiuyan,Ying Ying,Wang Yiming,Chen Xiaoqing,Zhao Yanli,Hu Guixue

(College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University,JilinChangchun130118)

In order to prepare the antigen for serological detection of Feline calicivirus,the primers were designed in according to the gene sequence of 1 FCV isolated from a leopard preserved in our laboratory.The 1 734 nucleotides in open reading frame 2(ORF2)were amplified and cloned into expression vector pET-28a to construct recombinant plasmid named pET-28a-FCV1 734.The recombinant plasmid was transformed into E.coli.The expression product induced by IPTG was determined by SDS-PAGE and Western blot.The result proved that the expressed protein had good reactogenicity.

Feline calicivirus;ORF2 gene;Expression

S852.65文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：1672-9692(2015)01-0001-04

2015-01-12

劉秋艷（1989-），女，在讀碩士，研究方向為動物病毒學(xué)。

胡桂學(xué)（1963-），男，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向為動物病毒學(xué)。

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303042）