溫度調(diào)控及不同營養(yǎng)強化劑對云紋石斑魚親魚血清性激素水平的影響

邵彥翔 ，陳超 ，李炎璐 ，張廷廷 ，張夢 ，孫濤 ，曲江波

（1.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點開放實驗室，中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；2.煙臺天源水產(chǎn)有限公司，山東 煙臺 264003）

云紋石斑魚（Epinephelus moara）俗稱草斑、油斑，隸屬硬骨魚綱（Osteichthyes），鱸形目（Perciformes），鮨科（Serranidae），石斑魚亞科（Epinephelinae），石斑魚屬（Epinephelus），是暖水性中下層礁棲魚類中的一種，主要分布于北太平洋西部以及中國臺灣沿海地區(qū)，是我國南方重要的海水養(yǎng)殖品種。它肉質(zhì)鮮美、生長迅速、具有較高的經(jīng)濟價值。云紋石斑魚野生資源有限，加之人為過度捕撈，自然資源逐漸減少。另外，云紋石斑魚在石斑魚屬中是比較難以繁育的種類之一，直至2001年，日本三重縣水產(chǎn)技術中心在云紋石斑魚人工繁育技術方面取得突破[1]。我國對云紋石斑魚的研究始于20世紀70年代后期，研究內(nèi)容主要涉及云紋石斑魚的生物學特性及形態(tài)發(fā)育[2-4]、攝食和生長特性[5]、淋巴囊腫病[6]、染色體核型[7]、營養(yǎng)需求與規(guī)?；B(yǎng)殖[8-10]等方面。

目前國內(nèi)對云紋石斑魚親魚營養(yǎng)強化以及溫度調(diào)控方面的研究很少。區(qū)又君[11]指出，我國海水魚類實現(xiàn)人工育苗大規(guī)模生產(chǎn)的前提是要積蓄足夠數(shù)量的親魚和獲得大量優(yōu)質(zhì)的受精卵。對親魚進行科學有效的營養(yǎng)強化培育，促使其性腺充分成熟和自然排卵，是獲得優(yōu)質(zhì)受精卵最為經(jīng)濟、有效的方式[12]。魚類能夠按照周圍環(huán)境的周期性綜合調(diào)整其生理功能，事實上，諸多生理活動過程的內(nèi)在周期性依賴于環(huán)境的周期性變化，根據(jù)環(huán)境的變化產(chǎn)生應答反應，光照和溫度對調(diào)節(jié)魚類的生殖周期最為重要[13-14]。本研究從溫度調(diào)控和營養(yǎng)強化兩個方面，開展了云紋石斑魚親魚培育的相關研究工作，以期為云紋石斑魚的人工繁育及健康養(yǎng)殖提供理論依據(jù)與參考。

1材料與方法

1.1 實驗魚的飼養(yǎng)

2015年3月—6月在煙臺天源水產(chǎn)有限公司開展溫度調(diào)控與營養(yǎng)強化實驗。選取270尾5齡以上、身體健壯、肥滿度好的健康云紋石斑魚親魚，平均體質(zhì)量（5.20±0.15）kg，體長（75.11±0.60）㎝，將實驗魚隨機分配到9個30m3的水泥池中養(yǎng)殖。初始養(yǎng)殖水溫（15±0.2）℃，投喂冰凍新鮮雜魚，每日飽食投喂2次（09:00、16:00）。實驗用水符合（GB11607-89）國家漁業(yè)水質(zhì)標準。鹽度（28.2±0.5），pH（7.4±0.5）。每日早、晚各換水60%，在保證水質(zhì)的前提下，確保換水前后溫差不大于0.5℃。

1.2 實驗設計

3月2號開始逐漸升高水體溫度進行溫度調(diào)控，由初始養(yǎng)殖水溫15℃逐漸升溫至17℃后保持水溫穩(wěn)定，4月初繼續(xù)升溫至19℃并保持一個月。5月份水溫保持在21℃，6月初水溫上升到23℃并一直保持穩(wěn)定到產(chǎn)卵結束。升溫期間保證足夠的光照強度及光照時間。每個養(yǎng)殖池上方配備兩個100W的燈泡，每天5：00開燈持續(xù)到19：00。將9個養(yǎng)殖水池隨機分成3組，實驗組分別投喂美國產(chǎn)蝦青素與日本產(chǎn)營養(yǎng)強化劑，投喂劑量每10 kg鮮雜魚添加15 g營養(yǎng)強化劑，空白組不添加。每月初用MS-222麻醉3組親魚并吸干魚體表面水分,用10 mL一次性無菌注射器從親魚尾部靜脈取血，血樣存放于10 mL離心管中并在4℃冰箱靜置5～6 h后離心，取上清液置于-80℃超低溫冰箱備用。

1.3 指標檢測

采用酶聯(lián)免疫分析（ELISA）的方法測試親魚血清中睪酮（T）和雌二醇（E2）的含量。酶聯(lián)反應分析的試劑盒購自齊一生物科技（上海）有限公司。E2的測定原理采用的雙抗體夾心法，用純化的E2抗體包被微孔板，制成固相抗體，往充滿單抗的微孔板中依次添加純化的E2，使之與被HRP標記的E2抗體相結合，經(jīng)過相關反應形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，對反應物進行徹底清洗后加入TMB顯色。TMB在HRP酶的催化作用下反應生成藍色物質(zhì)，與酸反應最終變?yōu)辄S色，反應產(chǎn)物顏色的深淺和血清中E2濃度呈正相關關系。在450 nm波長下用酶標儀測定其OD值，根據(jù)標準品畫出標準曲線，通過曲線計算樣品中魚E2含量。T含量的測定原理與E2相同。

圖1溫度調(diào)控對石斑魚親魚性激素的影響

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

采用Excel和SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理分析，顯著性差異以（P＜0.05）為標準，結果以平均值±標準誤（Mean±SE）的方式呈現(xiàn)。以Excel 2007統(tǒng)計軟件中的非線性回歸（Nonlinear regression）分析吸光度與激素含量的關系，選定R2最大值的函數(shù)關系式作為最佳曲線。E2標準曲線滿足方程y＝3.644 x3-12.464 x2+23.27x-4.9065，R2＝0.9981。T 標準曲線滿足方程y＝37.991 x3-134.98 x2+204.23x-55.875，R2＝0.99652。

2 結果

2.1 溫度調(diào)控對親魚性類固醇類激素的影響

如圖1所示，在溫度調(diào)控下云紋石斑魚親魚從3月初到5月初，血清中E2的含量上升后略微降低，6月初E2達到最大值但到9月份又表現(xiàn)出下降的趨勢。云紋石斑魚親魚血清中T含量在4月初略微上升，5月初血清T含量有所降低，6月初與E2變化類似，T含量達到最高峰，但在9月份呈現(xiàn)下降趨勢。

2.2 親魚性類固醇激素對營養(yǎng)強化響應

圖2不同強化劑對石斑魚親魚性激素的影響

選取云紋石斑魚親魚體內(nèi)激素變化明顯的4、5、6月份與空白組作對照，如圖2所示：4月初營養(yǎng)強化實驗組親魚血清中E2含量均高于空白對照組，并且添加日產(chǎn)營養(yǎng)強化劑的實驗組激素含量略高于添加蝦青素的實驗組。5月初添加蝦青素營養(yǎng)強化的實驗組含量高于添加日產(chǎn)強化劑的實驗組，并且兩個營養(yǎng)強化實驗組親魚血清中激素含量均高于空白對照組。6月份，兩種營養(yǎng)添加劑實驗組E2含量基本持平，均略高于空白對照組。

添加兩種營養(yǎng)強化劑強化后，云紋石斑魚血清中睪T含量呈現(xiàn)出較明顯變化。4月初，添加日產(chǎn)強化劑的實驗組效果略高于添加蝦青素組，且兩試驗組激素含量均高于空白對照組。5月初，兩試驗組血清中T含量基本持平，且均高于空白對照組。6月初兩實驗組血清中T含量均明顯高于空白對照組，添加蝦青素營養(yǎng)強化的實驗組與空白對照組相比呈現(xiàn)統(tǒng)計學意義差異（P＜0.05）。

3 討論

3.1 溫度調(diào)控對親魚性類固醇激素的影響

親魚血清性類固醇激素的含量由其在性腺等組織中的產(chǎn)生速度以及在血液和組織中的代謝速度等因素決定[15]，在親魚的生殖過程有著極其重要的作用。性類固醇激素在調(diào)節(jié)脊椎動物下丘腦-垂體-性腺軸的發(fā)育成熟及維持功能等方面都起著重要作用[16]。魚類的性類固醇激素主要有雌二醇（E2）、睪酮（T）、11-酮睪酮（11-KT）、17α，20β-雙羥孕酮（DHP）等幾種。內(nèi)源性類固醇激素主要有有雌激素、雄激素和孕激素三種，它們所涉及的許多生理功能通過核受體的介導來完成。在親魚性腺的整個發(fā)育過程中，內(nèi)源性類固醇激素中的一種或者兩種在發(fā)育過程中占據(jù)優(yōu)勢，它們之間可以相互轉化[17]。

親魚血清中E2水平隨著卵黃形成而出現(xiàn)相應變化，原因是E2能夠誘導肝細胞合成卵黃蛋白原[18-19]。本實驗中，云紋石斑魚的血清E2含量從4月份時開始逐漸升高，5月份出現(xiàn)略微下降，在6月繁殖季節(jié)達到最大值，并維持一段時間之后開始逐漸降低，血清E2的變化趨勢基本符合石斑魚卵巢發(fā)育的周年變化規(guī)律。與其他水生生物相似，在繁殖季節(jié)親魚血清T含量明顯高于非繁殖季節(jié)，但與其他水生生物如水生哺乳類、硬骨魚類等物種相比較，不同品種之間的血清T濃度還是存在較大差異[20,21]。本實驗中，3-5月份血清中T含量變化不顯著，6月份T含量迅速上升達到最大值。6月份血清性激素E2、T水平的迅速升高說明云紋石斑魚親魚性腺快速發(fā)育，從外觀可以觀察到親魚腹部明顯變大。9月時水體溫度逐漸下降，無論是人工培育還是自然生長的親魚，如果性腺發(fā)育健全，前期營養(yǎng)儲備充足，當達到適宜親魚產(chǎn)卵的溫度時，雌魚性腺可繼續(xù)發(fā)育，迎來第二次產(chǎn)卵高峰。若是這一階段水溫持續(xù)降低，再次產(chǎn)卵很快就會結束，與其他石斑魚相類似，云紋石斑魚卵巢也會在一年內(nèi)出現(xiàn)多次發(fā)育的情況[22-23]。

3.2 不同營養(yǎng)強化劑對親魚性類固醇激素的影響

蝦青素作為營養(yǎng)強化劑添加于水產(chǎn)動物的飼料中，可以顯著提高水產(chǎn)生物的生長性能，增強其等的免疫力，保護苗種抵御外界惡劣環(huán)境并促進其生長[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，蛙魚育苗期攝食添加蝦青素的飼料可以提高受精率并且促進卵的成熟、提高生殖力，減少胚胎死亡[26]。安振華等[27]指出，蝦青素提高親蝦的繁殖力，飼料中蝦青素添加量為20 g/kg時，可以顯著提高抱卵率與抱卵量，同時提高幼蝦的存活率及抵抗力。本實驗中，云紋石斑魚親魚經(jīng)過4個月營養(yǎng)強化投喂，實驗組親魚血清E2濃度明顯高于空白對照組，這與劉付永忠等[12]對斜帶石斑魚的研究結果一致，而未添加營養(yǎng)強化劑的對照組E2含量明顯低于添加強化劑實驗組，說明在云紋石斑魚親魚培育過程中，添加營養(yǎng)強化劑對繁殖期的親魚進行營養(yǎng)強化，對親魚性腺的正常發(fā)育會產(chǎn)生一定的影響。

各組親魚的血清T含量的變化，與羅海忠等[14]對鮸魚親魚營養(yǎng)強化的結果一致，投喂結束時各營養(yǎng)強化組親魚血清T濃度顯著高于對照組，說明繁殖前期對親魚營養(yǎng)強化對其性腺發(fā)育的重要性，如果不進行營養(yǎng)強化，可能會影響親魚卵巢末期的發(fā)育[28]，因此要想提高親魚的繁殖能力，必須在親魚性腺成熟前進行一系列的親魚營養(yǎng)強化培育。

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