羊傳染性膿皰病毒PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

陳小麗　福建省三明市農(nóng)業(yè)局　福建三明　365000

羊傳染性膿皰病毒PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

陳小麗福建省三明市農(nóng)業(yè)局福建三明365000

根據(jù)羊傳染性膿皰病毒（CPDV）B2L基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物，建立了檢測(cè)羊傳染性膿皰病毒DNA的PCR檢測(cè)方法。特異性、敏感性試驗(yàn)表明，該方法可以檢測(cè)2 pg DNA；并能與羊痘病毒、口蹄疫病毒進(jìn)行鑒別區(qū)分；結(jié)果表明該方法具有良好的特異性和敏感性，可對(duì)臨床組織病料中的CPDV進(jìn)行快速檢測(cè)。

羊傳染性膿皰病毒PCR特異性敏感性

羊傳染性膿皰，俗稱羊口瘡，是由痘病毒科、副痘病毒屬的傳染性膿皰病毒 （contagious pustular dermatitis virus，CPDV）引起的各類羊的一種急性、接觸性的傳染?。?］。該病主要危害羔羊，表現(xiàn)為急性接觸性傳染?；佳蛞钥谇火つこ霈F(xiàn)紅斑、痘疹、水皰、膿皰，繼之真皮結(jié)締組織高度增生，形成疣狀痂塊為特征。該病為人獸共患病，主要是通過接觸引發(fā)感染，動(dòng)物發(fā)病主要是口唇、舌、鼻和乳房等處的皮膚及黏膜出現(xiàn)一些水泡、潰瘍、結(jié)成厚厚的結(jié)痂等癥狀，受威脅的羊群發(fā)病率很高，通常都達(dá)到90%左右，但是病死率不高，只有25%或以下［2］，雖然病死率不高，但會(huì)引起發(fā)病羊只采食困難，還會(huì)影響發(fā)病母羊的乳量和乳質(zhì)，造成羊場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，診斷CPDV的方法有很多種，比如電子顯微鏡檢查、病毒分離、接種試驗(yàn)等［3-6］，而常規(guī)的病原學(xué)分離和血清學(xué)檢測(cè)方法，又存在操作繁雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、敏感性低等不足。由于CPDV的臨床發(fā)病癥狀與口蹄疫、羊痘癥狀很像，在加上此病還容易繼發(fā)感染一些細(xì)菌或病毒性的疾病，臨床經(jīng)驗(yàn)不豐富的獸醫(yī)工作人員容易誤診。本研究旨在建立一種快速、準(zhǔn)確、特異性高的PCR檢測(cè)方法，為羊口瘡的快速診斷提供了一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的方法，從而滿足基層快速檢疫的需要。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料與毒株臨床病料來自三明各縣 （市、區(qū)）收集的發(fā)病山羊的疑似病例；口蹄疫滅活疫苗購自金宇保靈生物藥品有限公司；山羊痘病毒標(biāo)準(zhǔn)弱毒株（B株）購自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；已經(jīng)提取出DNA的羊口瘡病毒由試劑公司贈(zèng)送；健康山羊皮膚由本單位實(shí)驗(yàn)室低溫冰箱保存。

1.1.2試劑核酸提取試劑盒、PCR試劑等購自大連寶生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中CPDV全基因序列，選擇B2L基因序列作為本試驗(yàn)的擴(kuò)增區(qū)，設(shè)計(jì)1對(duì)引物。引物序列為P1：5'-AGCGTGCGGTAGAAGCCCAGGAA-3'，P2：5'-GCGGCGGGCATCAACTACTACAAA-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段大小為362 bp，引物由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2.2病毒DNA的提取試劑公司贈(zèng)送已提取出的DNA的羊口瘡病毒樣品備用。羊病變皮膚組織用20mmoL/L PBS洗滌后，用滅菌剪刀剪碎后，加入鋼珠進(jìn)行勻漿，反復(fù)凍融2～3次，10 000 r/min離心10 min，收集上清備用。以上樣品各取500μL用柱純法提取DNA，提取出的DNA用50μL DEPC水溶解后即可用作PCR模板，放入冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為50μL，即25.0 μL的 2×PCR預(yù)混合物、2.0μL的上游引物（10 pmol/μL）和2.0μL的下游引物、1.0μL的DNA模板、20.0μL的DEPC水。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5 min，接下來35個(gè)循環(huán) （94℃變性1 min，55℃退火30 s和72℃延伸30 s），最后72℃延伸10min。對(duì)擴(kuò)增出的產(chǎn)物在加入gold view染色劑的1%瓊脂糖凝膠液中進(jìn)行電泳，電泳產(chǎn)物用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.4PCR擴(kuò)增的特異性用建立的PCR方法分別檢測(cè)羊口瘡病毒、臨床疑似病料、羊痘病毒、口蹄疫病毒和健康羊組織。

1.2.5PCR擴(kuò)增的敏感性以羊口瘡病毒DNA為樣本，測(cè)定OD260nm值，計(jì)算DNA的含量，然后將DNA 10倍比稀釋，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)所建立方法的敏感性。

1.2.6臨床樣品的檢測(cè)用建立的PCR方法對(duì)從三明市各縣（市、區(qū)）收集的16份病料進(jìn)行檢測(cè)。

2　結(jié)　果

2.1PCR擴(kuò)增經(jīng)PCR擴(kuò)增，出現(xiàn)1條特異性擴(kuò)增條帶（見圖1），與預(yù)期的目的片段大小一致（約362 bp）；健康的羊皮組織未擴(kuò)增出條帶。結(jié)果和預(yù)期一致，說明該方法可以用于羊口瘡病毒的擴(kuò)增。

圖1　PCR擴(kuò)增結(jié)果（M：DNA Ladder 2000；1：疑似發(fā)病羊群的病料；2：正常羊皮組織；3：陰性對(duì)照）

2.2PCR的特異性利用PCR方法，對(duì)已知的羊口瘡病毒、臨床發(fā)病的疑似病料、健康的羊皮組織、口蹄疫病毒和羊痘病毒一同擴(kuò)增。結(jié)果顯示，已知羊口瘡病毒和臨床疑似病料有1條大約是362 bp的條帶，其他的樣品孔沒有跑出任何的條帶顯示陰性（見圖2）。說明建立的PCR方法具有良好的特異性，與羊痘病毒、口蹄疫病毒等病毒核酸不能發(fā)生特異性結(jié)合。

2.3PCR擴(kuò)增的敏感性對(duì)DNA進(jìn)行10倍比稀釋，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果當(dāng)DNA模板為2 pg時(shí)仍可見清晰的目的擴(kuò)增條帶，說明建立的PCR方法具有較好的敏感性，微量的病毒含量也可被檢出 （見圖3）。

圖2　PCR特異性試驗(yàn)（M：DNA Ladder 2000；1：已知的羊口瘡病毒樣品1；2：疑似發(fā)病羊群的病料2；3：羊痘病毒；4：口蹄疫病毒；5：健康羊組織；6：陰性對(duì)照）

圖3　PCR敏感性試驗(yàn)（M：DNA Ladder 2000；1：2 000 ng；2：200 ng；3：20 ng；4：2 ng；5：200 pg；6：20 pg；7：2 pg；8：0.2 pg；9：0.02 pg）

2.4臨床樣品的檢測(cè)對(duì)從三明市收集的2個(gè)規(guī)模養(yǎng)羊場(chǎng)16頭臨床發(fā)病羊的病樣進(jìn)行檢測(cè)，15份PCR擴(kuò)增均為CPDV陽性，檢出率為94%，說明臨床檢出率高，建立的PCR方法適合于臨床診斷。

3　討　論

羊口瘡是發(fā)生在羊身上的一種常見病，雖然病死率不高，但發(fā)病率較高，一旦羊場(chǎng)染上該病很難根治，勢(shì)必影響羊的生產(chǎn)和發(fā)育，最終造成經(jīng)濟(jì)損失。羊口瘡的臨床表現(xiàn)與羊痘和羊口蹄疫都很相似，經(jīng)驗(yàn)不豐富的養(yǎng)殖戶很容易混淆而造成誤診。本單位中心實(shí)驗(yàn)室使用的PCR方法檢測(cè)羊口瘡病毒DNA具有特異性好的特征，同時(shí)對(duì)羊口瘡、口蹄疫、羊痘這幾種在臨床上容易混淆的病毒都用該方法擴(kuò)增條帶，結(jié)果只發(fā)現(xiàn)羊口瘡有擴(kuò)出特異性的目的條帶，其他疫病并未擴(kuò)出條帶。

近幾年來，三明的羊養(yǎng)殖規(guī)模一直在擴(kuò)大，從散戶變成小養(yǎng)殖戶、小養(yǎng)殖戶轉(zhuǎn)變?yōu)榇箴B(yǎng)殖戶。三明市12個(gè)縣（市、區(qū)）年出欄率100頭以上的養(yǎng)羊場(chǎng)達(dá)200多個(gè)，平均一個(gè)縣就有20個(gè)左右的羊場(chǎng)。小小的一個(gè)三明市，面對(duì)這么龐大的羊養(yǎng)殖戶，我們的人力物力疲于應(yīng)對(duì)。目前本單位中心實(shí)驗(yàn)室了解的信息是，大型羊場(chǎng)管理規(guī)范，疫病的防控措施得當(dāng)，羊口瘡發(fā)生情況較少，但是小型羊場(chǎng)衛(wèi)生、防疫條件都比較落后，許多散戶和小型場(chǎng)缺乏專業(yè)知識(shí)，常把羊口瘡誤診為其他疾病，治療措施不當(dāng)，已經(jīng)被羊口瘡困擾多年了。這些養(yǎng)殖戶有個(gè)共同的特點(diǎn)就是臨床發(fā)病不嚴(yán)重，有的只是出現(xiàn)一些輕微的癥狀，口唇邊緣長(zhǎng)結(jié)痂，一般不會(huì)造成死亡，養(yǎng)殖人員比較麻痹大意，有時(shí)不管理，時(shí)間一長(zhǎng)輕微的口瘡癥狀也能自行消失，有的養(yǎng)殖人員用竹片刮結(jié)痂、刮到患處有血絲即可，并在患處涂抹2%紫藥水。幾天后癥狀就能消失，但過一段時(shí)間又會(huì)復(fù)發(fā)，反反復(fù)復(fù)給養(yǎng)羊業(yè)帶來了經(jīng)濟(jì)損失。

總之，羊口瘡可防、可控、可治療，但也不能掉以輕心。養(yǎng)殖過程中一定要做好環(huán)境衛(wèi)生、注意動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)搭配，提高動(dòng)物抵御疾病的能力，同時(shí)，對(duì)一些該病的高發(fā)區(qū)還應(yīng)做好疫苗的防疫，定期對(duì)羊群進(jìn)行監(jiān)測(cè)檢查，分析評(píng)估防疫的效果，從而從源頭上杜絕該病的發(fā)生。

［1］殷震，劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，1997.

［2］何水林，陳杰，蔡玉書，等.羊口瘡病毒的分離與鑒定［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，2002，9（3）：21-23.

［3］白積榮，沈正達(dá)，王錫貞，等.羊口瘡病毒形態(tài)發(fā)生的電鏡觀察［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，1985（11）：34-36.

［4］張素珍，張惠安，鄺明慧，等.羊口瘡病原的分離與鑒定的研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，1987（4）：3-4.

［5］陳燕軍.羊口瘡的研究血清學(xué)方法的研究［J］.獸醫(yī)科技雜志，1982（7）：14-19.

［6］龐理化，程慶華，侯秀芬，等.羊口瘡病毒組織培養(yǎng)初報(bào)［J］.青海畜牧獸醫(yī)雜志，1982（3）：66-69.

Development and application of the PCR method for CPDV detection

Chen Xiaoli
（Sanming city agriculture bureau，F(xiàn)ujian 365000）

A PCR assay for the rapid and sensitive detection of CPDV was developed by using a pair of primers designed according to the published B2L gene sequence of CPDV.The sensitivity of the assay can be up to 2 pg.The result of amplification with CPV、FMDV were negative.The result showed that the assay was specific and highly sensitive，and can be used for fast diagnosis and epidemic survey.

CPDV PCR specificity sensitivity

A

1003-4331（2015）01-0013-03