雛番鴨病毒性肝炎病毒的分離與鑒定

張阿娥莊培德

（1.福建省泉州市洛江區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 362011；2.福建省泉州市洛江區(qū)河市畜牧獸醫(yī)站　362011）

雛番鴨病毒性肝炎病毒的分離與鑒定

張阿娥1莊培德2

（1.福建省泉州市洛江區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 362011；2.福建省泉州市洛江區(qū)河市畜牧獸醫(yī)站362011）

從洛江區(qū)臨床發(fā)病鴨分離到2株病毒，2株分離病毒能夠致死雞胚，能被Ⅰ型鴨病毒性肝炎標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒高免血清特異性中和。分離毒株在雞胚上傳代培養(yǎng)，并測(cè)定ELD50分別為10-6.32/0.2m L、10-5.49/0.2m L；經(jīng)動(dòng)物回歸試驗(yàn)，對(duì)1日齡雛番鴨的致死率分別為80%和70%，雛番鴨出現(xiàn)明顯的角弓反張姿態(tài)，剖檢可見(jiàn)肝臟出血斑、出血點(diǎn)，為鴨病毒性肝炎的典型癥狀，表明分離到的病毒為Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒（DHV-I）。

鴨病毒性肝炎分離鑒定

鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒 （Duck Hepatitis Virus，DHV）引起的一種急性接觸傳染性疾病，主要侵害4周齡以內(nèi)的雛鴨，特別是1周齡內(nèi)的雛鴨最易感染，死亡率可達(dá)90%以上［1］，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的傳染病之一。臨床表現(xiàn)為痙攣，頭向背部后仰，呈“角弓反張”，俗稱“背脖病”，剖檢癥狀見(jiàn)肝臟有血斑或出血點(diǎn)，以肝炎為主。1963年以來(lái)，上海、北京、山東和福建等地陸續(xù)報(bào)道有該病的發(fā)生，由Ⅰ型DHV所引起［2-5］。2014年6月，泉州市洛江區(qū)某2家番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)2～15日齡雛番鴨發(fā)生疑似Ⅰ型鴨肝炎的疾病，發(fā)病雛番鴨表現(xiàn)為突然發(fā)病、角弓反張并很快死亡。為掌握發(fā)病原因，對(duì)病原進(jìn)行了分離鑒定，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料I型鴨肝炎病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所；抗I型鴨病毒性肝炎病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清由福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)科學(xué)院動(dòng)物保健研究所惠贈(zèng)；SPF雞胚購(gòu)自山東SPF種雞場(chǎng)；雛番鴨購(gòu)自莆田某鴨場(chǎng)1日齡非免疫雛番鴨。

1.2待檢病料取自洛江區(qū)某2家番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)1～ 14日齡死亡雛番鴨的肝臟，肝臟呈現(xiàn)腫大、出血點(diǎn)、出血斑的典型癥狀，臨床診斷為疑似鴨病毒性肝炎病毒感染。命名為MJ株和HS株。

1.3病料處理無(wú)菌采取病死雛番鴨肝組織，剪碎后放入研缽中，加入PBS研磨后，加入雙抗，將懸液4 000 r/min離心30min，取上清液，0.22μm濾器過(guò)濾，分裝過(guò)濾液（病毒液）于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4細(xì)菌分離無(wú)菌取病死雛鴨肝臟，接種于普通瓊脂平板、巧克力瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板，置37℃恒溫箱和CO2培養(yǎng)箱48 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.5雞胚接種每次取0.2 mL病毒液接種10枚9日齡SPF雞胚尿囊腔，每天照蛋觀察3次，連續(xù)3～5 d，收獲24 h后死亡雞胚尿囊液和胚體，經(jīng)普通瓊脂培養(yǎng)基雜檢，連續(xù)傳代5次。

1.6分離毒株雞胚半數(shù)致死量（ELD50）測(cè)定2個(gè)分離毒株第5代尿囊液分別作6個(gè)稀釋度，即10-3～10-8，每個(gè)稀釋度取0.2mL接種5枚雞胚，置37℃孵化，每天觀察記錄結(jié)果，6 d后按Reed-Muench法計(jì)算ELD50。

1.7雞胚中和試驗(yàn)取2個(gè)分離毒株第5代尿囊液稀釋至200 ELD50，分別與I型DHV陽(yáng)性血清等量混合，37℃水浴1 h，取0.2mL接種SPF雞胚，同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)毒株、分離毒株、生理鹽水作對(duì)照，每天照胚3次，觀察6 d，記錄死亡胚數(shù)。

1.8氯仿敏感性試驗(yàn)取2個(gè)分離毒株第5代尿囊液2mL，加入96μL氯仿，4℃振蕩10min，5 000 r/min離心5min，吸取上層液，連續(xù)10倍稀釋，取10-3-10-75個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度0.2 mL接種雞胚5枚，37℃孵化，每天照胚3次，記錄死亡胚數(shù)，觀察6 d，測(cè)ELD50。對(duì)照病毒液加入96 uL生理鹽水，作同樣的處理和滴定。氯仿處理病毒液的滴定比對(duì)照病毒液下降2個(gè)對(duì)數(shù)以上者，判為對(duì)氯仿敏感。

1.9動(dòng)物回歸試驗(yàn)選擇無(wú)鴨病毒性肝炎母源抗體的1日齡雛番鴨40羽，分為4組。分別取2個(gè)分離毒株第5代尿囊液，按照0.2mL/羽攻毒劑量，采取腿部肌肉注射方式對(duì)第1組、第2組各10羽番鴨進(jìn)行攻毒。第3組為標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株對(duì)照，第4組為生理鹽水對(duì)照，方法均同上。4組試驗(yàn)番鴨均隔離飼養(yǎng)，每天記錄番鴨發(fā)病和死亡情況，并對(duì)死亡雛番鴨進(jìn)行剖解。

2　結(jié)果與分析

2.1病毒分離病毒液接種雞胚傳代6次，從第2代開(kāi)始，接種的雞胚多數(shù)在60～120 h出現(xiàn)死亡。病毒液在雞胚上傳代4次后，雞胚死亡多集中在48～72 h，死亡雞胚發(fā)育不良，全身出血，肝臟有出血點(diǎn)或出血斑，收集該雞胚病毒尿囊液，置-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2細(xì)菌分離死亡雛番鴨肝臟經(jīng)普通瓊脂、巧克力瓊脂和麥糠凱瓊脂平板培養(yǎng)，均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.3雞胚中和試驗(yàn)2株分離毒株與I型DHV陽(yáng)性血清等量混合后接種雞胚，均未見(jiàn)雞胚死亡，病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株對(duì)照組雞胚全部死亡，表明2個(gè)分離毒株均能被I型鴨病毒性肝炎陽(yáng)性血清中和。

2.4分離毒株ELD50測(cè)定通過(guò)對(duì)分離毒株2次重復(fù)試驗(yàn)，按Reed-Muench法計(jì)算出分離株MJ5和HS5在雞胚中的半數(shù)致死量分別為 10-6.32/0.2 mL、10-5.49/0.2mL。

2.5氯仿敏感試驗(yàn)2株分離毒株經(jīng)氯仿處理后接種雞胚，9枚雞胚均死亡，與對(duì)照組結(jié)果沒(méi)有差異。經(jīng)氯仿處理后MJ5株、HS5株病毒的ELD50分別為10-5.34/0.2 mL、10-4.68/0.2 mL，對(duì)照組病毒的ELD50分別為10-6.3/0.2mL、10-5.49/0.2mL，表明2株分離毒株對(duì)氯仿不敏感、無(wú)囊膜。

2.6動(dòng)物回歸試驗(yàn)2株分離毒株分別接種感染1日齡雛番鴨，對(duì)雛番鴨的致死率分別為80%和70%（見(jiàn)表1），死亡時(shí)間多數(shù)集中在72 h以內(nèi)，癥狀表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)停止運(yùn)動(dòng)，蹲伏并半閉眼、打盹、倒臥，兩腿痙攣性后伸，頭向后背，一般在出現(xiàn)癥狀后約1 h死亡，死亡雛番鴨呈“角弓反張”（見(jiàn)圖1），剖檢死亡雛番鴨，肝臟腫大、出血，表面有出血斑、出血點(diǎn)（見(jiàn)圖2），上喙淤血，膽囊膽汁充盈，呈青褐色；有的可見(jiàn)腎臟出血點(diǎn)、脾臟壞死。

表1　動(dòng)物回歸試驗(yàn)情況

圖1　死亡雛番鴨“角弓反張”

圖2　死亡雛番鴨肝臟出血

3　討論與小結(jié)

1）1950年，Levine首次報(bào)道運(yùn)用雞胚中和試驗(yàn)開(kāi)展DHV-I的診斷［6］。1969年，Hwang研究表明運(yùn)用雞胚中和試驗(yàn)開(kāi)展DHV-I診斷，試驗(yàn)準(zhǔn)確、重復(fù)性好。目前雞胚中和試驗(yàn)仍然是公認(rèn)的權(quán)威方法，因此，運(yùn)用雞胚中和試驗(yàn)，對(duì)洛江區(qū)域內(nèi)分離的疑似鴨肝炎病毒株進(jìn)行鑒定，但雞胚中和試驗(yàn)存在操作程序多、費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)，不適于快速診斷，對(duì)于快速、特異、操作方便并適用臨床大量樣品的檢測(cè)，可參照Yang M等成功建立的RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行［7］。

2）試驗(yàn)從疑似鴨病毒性肝炎的病死鴨病料中分離到2株病毒，該病毒能致死雞胚，病毒能被Ⅰ型鴨肝炎病毒標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒高免血清特異性中和；病毒人工感染3日齡雛番鴨，在很大程度上復(fù)制出了DVH的流行特點(diǎn)，如發(fā)病急、病程短、病死率高，其臨床癥狀及剖檢病變與自然感染病例相同，結(jié)果表明洛江轄區(qū)內(nèi)分離的2株病毒為Ⅰ型鴨病毒性肝炎病毒。

3）試驗(yàn)表明，洛江轄區(qū)內(nèi)番鴨養(yǎng)殖業(yè)存在鴨病毒性肝炎流行，若疫情被延誤，對(duì)雛鴨的致死率可達(dá)90%，轄區(qū)、鎮(zhèn)獸醫(yī)部門和番鴨養(yǎng)殖場(chǎng)業(yè)主應(yīng)高度重視，督促指導(dǎo)轄區(qū)內(nèi)番鴨養(yǎng)殖業(yè)主落實(shí)防疫、消毒、自繁自養(yǎng)和全進(jìn)全出等疫病防控措施，尤其是要把好免疫關(guān)，制定合理的免疫程序，應(yīng)用疫苗進(jìn)行預(yù)防接種，減少該病的發(fā)生，對(duì)于無(wú)母源抗體的雛番鴨，在l～3日齡采用飲水方式用鴨病毒性肝炎弱毒疫苗免疫1次，可有效防控雛鴨發(fā)病；對(duì)于種鴨，在開(kāi)產(chǎn)前間隔15 d接種2次鴨病毒性肝炎疫苗，之后隔3～4個(gè)月加強(qiáng)免疫1次，可以保證雛鴨具有較高的母源抗體，獲得較好的保護(hù)。

［1］卡爾尼克BW.禽病學(xué)［M］.10版.高福，蘇敬良，譯.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999.

［2］郭玉璞，潘文石.北京鴨病毒性肝炎血清型的初步鑒定［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，1984，10（11）：2-3.

［3］劉兆宇，程安.春雛鴨病毒性肝炎的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)家禽，2002，10（24）：6-9.

［4］王桂英，朱明霞，王岳.Ⅰ型鴨肝炎病毒的分離與鑒定［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（10）：66-68.

［5］王劭，朱小麗，程曉霞.鴨病毒性肝炎病毒分離鑒定及VP1基因序列分析［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，23（4）：359-363.

［6］Levine.P P.A hitherto-undescribed virus disease of ducks in North America［J］.Cornell Veterinarian，1950，40（4）：71-86.

［7］Yang M，Cheng A，W ang M，et a1.Development and application of a one-step real-time Taqman RT-PCR assay for detection of Duck hepatitis virus typel［J］.Virol Methods，2008，53（I）：55-60.

Isolation and analysis ofmuscovy duck hepatitis virus

Zhang Ae1Zhuang Peide2
（1.Animal disease prevention and control center of Luojiang county，Quanzhou 362011；2.Veterinary service center of Heshi，Luojiang county，Quanzhou 362011）

Two virus isolateswere isolated from dead ducks in Luojiang county.The iso1ated virus caused death of chicken embryos，and was specifically neutralized by anti-duck hepatitis virus type Ihyper immune serum.The isolateswere passed in chicken embryos and the titerswere 10-6.32ELD50/0.2mL to 10-5.49ELD50/0.2 mL.Typical clinical signs and pathological changes such as opisthotonos and hepatic hemorrhage were observed when the isolates were inoculated to muscovy ducklings，resulting in 80%to 70%mortality. The resu1ts confirmed that the isolated viruswere a duck hepatitis virus serotype I（DHV-I）.

duck hepatitis virus iso1ation identification

A

1003-4331（2015）01-0008-03