Nrf2/Keap1-ARE通路與心肌缺血再灌注損傷

丁士驁（綜述） 梅舉（審校）

Nrf2/Keap1-ARE通路與心肌缺血再灌注損傷

丁士驁（綜述） 梅舉（審校）

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）是指心肌組織缺血后再恢復(fù)灌注，缺血心肌的損害不僅沒有好轉(zhuǎn)反而出現(xiàn)反常增加的現(xiàn)象[1]。MIRI是臨床醫(yī)生面臨的一大難題[2-4]。由于心外科手術(shù)需要無血、相對(duì)靜止的環(huán)境，在體外循環(huán)、心臟停跳下進(jìn)行，而體外循環(huán)心臟停跳下手術(shù)則需要阻斷心臟供血，注入停跳液促使心臟停跳，心臟上操作完成后再恢復(fù)心臟血供，促使心臟復(fù)跳，因此體外循環(huán)下心臟停跳過程就是一個(gè)缺血再灌注損傷的過程。在經(jīng)歷體外循環(huán)后的心臟病患者術(shù)后恢復(fù)過程及遠(yuǎn)期療效很大程度與缺血再灌注損傷相關(guān)，所以MIRI的研究具有重要的意義。但MIRI損傷的病理生理機(jī)制是復(fù)雜的，到目前為止都還不完全清楚，亦缺乏有效的治療策略[5]。

氧化應(yīng)激是指機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基增多或清除能力降低，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）在細(xì)胞內(nèi)蓄積而引發(fā)的氧化損傷過程[6]。氧化應(yīng)激長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是開始MIRI損傷的一個(gè)關(guān)鍵因素，與MIRI的發(fā)生密切相關(guān)。雖然動(dòng)物研究表明，氧化應(yīng)激參與MIRI損傷過程，但是在人類的研究還比較少見，使用抗氧化劑的臨床干預(yù)研究的效果也沒有明確的結(jié)論[7]。

氧化應(yīng)激反應(yīng)和轉(zhuǎn)錄因子-核因子相關(guān)因子2（Nrf2）密切相關(guān)[8]。Nrf2/Keap1-ARE通路是目前為止發(fā)現(xiàn)的最為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，在心血管系統(tǒng)中的分布非常廣泛，誘導(dǎo)激活后可上調(diào)內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，從而減輕心肌的氧化損傷[9]。同時(shí)Nrf2是氧化應(yīng)激的感受器，在參與細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化應(yīng)激中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是抗氧化應(yīng)激的重要轉(zhuǎn)錄因子[10]。本文就Nrf2/Keap1-ARE通路與心肌缺血再灌注損傷的相關(guān)研究進(jìn)展作一綜述。

1 Nrf2與Keap1結(jié)構(gòu)與功能

1.1 Nrf2結(jié)構(gòu)與功能 Nrf2是CNC-bZIP（cap‘n’collar subfamily of basic leucinezipper）即CNC亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員中活力最強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，幾乎在各種細(xì)胞內(nèi)都可表達(dá)。它可與DNA的NF-E2區(qū)結(jié)合[11]。NF-E2區(qū)包含抗氧化反應(yīng)原件ARE序列（GTGACTCAGCA），含有6個(gè)不同的功能區(qū)，分別被命名為Neh 1～6[12]。其中Neh1結(jié)構(gòu)中有一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（bZIP），它與小Maf蛋白（包括MafG、MafK、MafF）形成異二聚體結(jié)構(gòu)，是Nrf2識(shí)別抗氧化應(yīng)答元件（ARE）上DNA堿基序列并與之結(jié)合的重要前提，也是啟動(dòng)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的重要基礎(chǔ)[13]。Neh2區(qū)是Nrf2與胞漿蛋白Keap1結(jié)合區(qū)，同時(shí)Neh2區(qū)對(duì)親電子試劑、抗氧化劑具有高度敏感性[14]。Nrf2與抗氧化應(yīng)答元件ARE協(xié)同調(diào)節(jié)重要的抗氧化基因Ⅱ相解毒酶基因，Ⅱ相解毒酶包括血紅素氧合酶（HO－1）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD)、NAD（P）H醌類氧化酶等，它們通過多種協(xié)同作用構(gòu)成細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)，共同清除ROS，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位平衡[15]。

1.2 Keap1結(jié)構(gòu)與功能 Keap1是一個(gè)與胞漿肌動(dòng)蛋白結(jié)合的多肽，富含半胱氨酸殘基，其624個(gè)氨基酸中具有25個(gè)半胱氨酸，且這些半胱氨酸序列在人類、大鼠和小鼠的基因組中高度保守，共含5個(gè)區(qū)[11]。其中DGR區(qū)是Keap1與Nrf2中Neh2的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)也是Keap1與胞漿內(nèi)肌動(dòng)蛋白的結(jié)合區(qū)位。BTB′POZ區(qū)是與肌動(dòng)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子中鋅指結(jié)構(gòu)域相互作用，能夠介導(dǎo)Keap1二聚體化并且與Keap1-Nrf2的結(jié)合有關(guān)[16]。干預(yù)區(qū)域（IVR）含有25個(gè)半胱氨酸，在IVR的半胱氨酸殘基會(huì)引起DGR或Keap1分子的構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致Nrf2從Keap1解離，并且這種富含的半胱氨酸基團(tuán)很可能作為氧化應(yīng)激的主要傳感器分子[17]。

2 Nrf2′Keap1的激活及調(diào)節(jié)機(jī)制

如圖1所示，在生理狀態(tài)下，內(nèi)生Nrf2消除是相當(dāng)快的，絕大部分Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中以非活性狀態(tài)和Keapl相結(jié)合，通過泛素化方式降解。常態(tài)下Keap1在胞質(zhì)中錨定于肌動(dòng)蛋白，促使胞質(zhì)內(nèi)的Nrf2持續(xù)泛素化并被蛋白降解，抑制Nrf2從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到核內(nèi)[18]。ROS使Keap1和Nrf2磷酸化，導(dǎo)致絲裂原活化蛋白激酶（MAPK，ERK，p38）、蛋白激酶C（PKC）、磷脂酰肌醇激酶3（PI3K）和其他蛋白質(zhì)激活，Keap1從Kaep1-Nrf2復(fù)合物中解離，Nrf2的活性增加，有轉(zhuǎn)錄活性的Nrf2易位到細(xì)胞核內(nèi)，與Maf蛋白形成雜化二聚體[19]，然后與ARE啟動(dòng)子部位結(jié)合，啟動(dòng)Nrf2下游靶基因即過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）、醌氧化還原酶（NQO1）、血紅素加氧酶（HMOX1）等的表達(dá)，而這些蛋白可以抑制氧化應(yīng)激損傷，故Keap1對(duì)Nrf2功能起負(fù)性調(diào)控作用[20]。目前發(fā)現(xiàn)真核細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的抗氧化蛋白均受到Nrf2的調(diào)控。近年來國(guó)外研究表明，Nrf2表達(dá)水平異?；蚱滢D(zhuǎn)錄活性受損與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生密切相關(guān)[7]。

圖1 Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)制示意圖

3 氧化應(yīng)激與心肌缺血再灌注損傷

以往的研究發(fā)現(xiàn)，心肌組織血流供應(yīng)的減少和血流再灌注是導(dǎo)致組織缺血損傷的主要影響因素。典型的例子就是心臟體外循環(huán)手術(shù)。因此，盡快恢復(fù)血流供應(yīng)是缺血后的首要臨床目標(biāo)。然而，缺血區(qū)域血流的快速恢復(fù)又導(dǎo)致?lián)p傷程度的增加，原因就是在缺血初期有氧化應(yīng)激的損傷[21]。

心肌組織在缺血時(shí)特別容易損傷，因?yàn)樾募〖?xì)胞在正常血流灌注時(shí)氧的攝入在80%左右，所以當(dāng)動(dòng)脈血流嚴(yán)重匱乏時(shí)，心肌細(xì)胞再也無法顯著提高氧的攝入，導(dǎo)致缺血后心肌的損傷較其他組織更為嚴(yán)重[5]。當(dāng)血流恢復(fù)時(shí)，大量的炎癥反應(yīng)會(huì)顯著提高氧化應(yīng)激，超過原有的抗氧化防御系統(tǒng)的防御能力，心肌細(xì)胞損傷或死亡，最后影響心功能[22]。而目前的研究發(fā)現(xiàn)，真核細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的抗氧化蛋白均受到Nrf2的調(diào)控，這樣的氧化應(yīng)激過程使Nrf2成為保護(hù)心肌免受缺血再灌注損傷的最佳候選靶點(diǎn)[23]。

在H9c2細(xì)胞模型中，模擬缺血再灌注（10小時(shí)缺氧，16小時(shí)復(fù)氧）導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增加。在相同條件下，使用Ⅱ相抗氧化酶誘導(dǎo)劑D3T處理大鼠心肌細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平明顯減少。在這些細(xì)胞中Nrf2 mRNA和蛋白表達(dá)增加，這表明Nrf2可能缺血再灌注后細(xì)胞內(nèi)ROS的水平控制非常重要。相反，單純阻塞大鼠心臟左冠狀動(dòng)脈前降支30分鐘后Nrf2核蛋白的表達(dá)減少。這些實(shí)驗(yàn)表明Nrf2具有啟動(dòng)抗氧化防御系統(tǒng)應(yīng)對(duì)再灌注引起的氧化應(yīng)激損傷的作用[24]。

Nrf2的快速激活已被證實(shí)能夠減少心肌缺血再灌注的損傷。國(guó)內(nèi)外對(duì)于Nrf2通路保護(hù)心肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)已有一些報(bào)道。Mukherjee等[19]在西蘭花中提取萊菔硫烷等硫氧化還原蛋白，建立心肌缺血再灌注模型后，灌胃給予萊菔硫烷后能減少心肌梗死面積，同時(shí)發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中HO－1（已知的Nrf2應(yīng)答基因）的表達(dá)水平明顯增高，這說明萊菔硫烷能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞Nrf2應(yīng)答基因的表達(dá)。Calvert等[25]用H2S在心臟缺血再灌注前進(jìn)行預(yù)處理，建立模型后發(fā)現(xiàn)心肌梗死面積、肌鈣蛋白I和氧化應(yīng)激的水平均出現(xiàn)不同程度的下降，試驗(yàn)中不僅僅是Nrf2的早期激活增加，心肌細(xì)胞中的HO－1和氧化還原蛋白（TRX1）的水平也增加，說明在心肌缺血損傷的抗氧化應(yīng)激機(jī)制中，Nrf2的作用非常顯著。張揚(yáng)等建立體外Langendorff灌流模型，利用較高濃度的4-HNE處理心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示4-HNE能夠誘導(dǎo)Nrf2的表達(dá)并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，并增強(qiáng)谷氨酰半胱氨酸連接酶γ（GCL）的表達(dá)，使得GSH的表達(dá)與對(duì)照組比較有顯著提高。而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，予以4 mg/ kg的4-HNE靜脈注射實(shí)驗(yàn)小鼠，結(jié)果顯示小鼠心肌細(xì)胞的GSH水平明顯升高，左心功能恢復(fù)更加迅速；相比而言，Nrf2基因敲除小鼠中未觀察到這種4-HNE的心肌保護(hù)作用[26]。另外，Sussan等[27]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)三萜CDDO咪唑能通過增強(qiáng)Nrf2的表達(dá)起到心肌保護(hù)的作用。鄧超等[28]的研究證實(shí)α-硫辛酸通過Nrf2通路對(duì)心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。我國(guó)的傳統(tǒng)中藥在心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)方面潛力很大，崔振國(guó)等[5]在大鼠心臟H9c2細(xì)胞和人類胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞（hESC-CMs）中建立心肌缺氧復(fù)氧模型，予以黃芩素處理，證明了黃芩素可有效減輕再灌注后的氧化應(yīng)激，提高了大鼠心肌對(duì)抗I/R損傷的能力，兩種細(xì)胞內(nèi)的Nrf2和HO-1的表達(dá)增加，同時(shí)黃芩素可破壞Nrf2與Keap1形成復(fù)合體，Nrf2的核轉(zhuǎn)位增加，然而Nrf2的干擾小RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染可以阻止黃芩素的保護(hù)作用。這些研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均得出相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，Nrf2的誘導(dǎo)物在發(fā)揮心肌保護(hù)的過程中，不僅僅誘導(dǎo)增強(qiáng)Nrf2的表達(dá)與轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，同時(shí)還能增強(qiáng)與Nrf2相關(guān)產(chǎn)物如HO－1、GSH、TRX等的表達(dá)。

4 Nrf2與心肌缺血再灌注損傷臨床研究展望

心肌缺血再灌注損傷的研究已經(jīng)進(jìn)行了幾十年，各種干預(yù)措施也已被證明能降低動(dòng)物心肌梗死面積；然而，這些干預(yù)措施卻不能很好地應(yīng)用于人類。Nrf2的誘導(dǎo)劑如萊菔硫烷、硫化氫、三萜CDDO咪唑和CO對(duì)心肌有保護(hù)作用，還有我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，在動(dòng)物模型中均證明有心肌保護(hù)的作用，但是他們都缺乏臨床應(yīng)用的安全數(shù)據(jù)，可能臨床療效并不確定，結(jié)果也難以控制[29]。Kappos等[30]將口服的細(xì)胞保護(hù)劑——延胡索酸成功應(yīng)用于銀屑病或多發(fā)性硬化癥患者的Ⅱ期臨床試驗(yàn)，證實(shí)了口服延胡索酸及其衍生物（FADs）在抗氧化應(yīng)激的治療中是確實(shí)有效的，也是安全的，且此類FADs亦是人體內(nèi)已有的物質(zhì)，參與體內(nèi)三羧酸循環(huán)，副作用小，這為我們研究此類藥物在其他疾病中的作用提供了強(qiáng)有力的依據(jù)，例如評(píng)估FADs在急性冠脈綜合征和實(shí)行心臟手術(shù)后引起的心肌損傷的保護(hù)作用。Ashrafian等[31]研究發(fā)現(xiàn)敲除延胡索酸水化酶基因的小鼠比野生型小鼠更不易遭受心肌缺血再灌注的損傷，同樣，外界給予正常小鼠延胡索酸亦能起到心肌保護(hù)作用，但是敲除Nrf2基因后，延胡索酸的保護(hù)作用的減弱具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，肯定了延胡索酸通過Nrf2-ARE通路的心肌保護(hù)作用。所以，F(xiàn)ADs是安全可靠的心肌保護(hù)的物質(zhì)，在延胡索酸類似物中探尋更加安全高效的心肌保護(hù)藥物具有重要的臨床意義，值得我們進(jìn)一步研究，同時(shí)Nrf2/ ARE信號(hào)通路的激活亦有望成為心肌缺血再灌注損傷治療的新靶點(diǎn)。

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The Nrf2/Keap1-ARE pathway and m yocardial ischem ia reperfusion injury

Nrf2/Keap1-ARE通路； 氧化應(yīng)激； 心肌缺血再灌注損傷

The Nrf2/Keap1-ARE pathway； Oxidative stress； Myocardial ischemia reperfusion injury

上海市科委資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：13XD1403200）

作者單位：200092 上海市，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院心胸外科

梅舉，E-mail：ju-mei63@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2015.05.001

R654.2

A

1672-5301（2015）05-0385－04

2015-02-13）