野生油蘑菌種分離與純化的研究

潘 靜，郭夢(mèng)橋，劉偉偉

（黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163319）

野生油蘑菌種分離與純化的研究

潘 靜，郭夢(mèng)橋，劉偉偉

（黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江 大慶 163319）

以在大慶市不同地區(qū)采集的野生油蘑為試驗(yàn)材料，選取子實(shí)體不同部位進(jìn)行組織分離純化，并對(duì)不同培養(yǎng)基下子實(shí)體的萌發(fā)狀況進(jìn)行了比較研究，得出PDA+楊樹樹葉浸泡液培養(yǎng)基最適宜油蘑菌絲的萌發(fā)，子實(shí)體表面的消毒與否對(duì)菌絲的生長產(chǎn)生影響。

野生油蘑；分離；純化

油蘑屬于傘菌目白蘑科口蘑屬，是一種商品價(jià)值極高的野生食用菌，其口感滑膩，香氣濃郁，風(fēng)味獨(dú)特，具較高的營養(yǎng)價(jià)值。野生油蘑發(fā)生于秋季楊樹林下，喜在沙質(zhì)土壤上繁殖生長。因長期的過度采摘和生態(tài)環(huán)境的不斷惡化，許多地區(qū)的野生油蘑資源日益減少，有效保護(hù)和合理開發(fā)野生油蘑資源，實(shí)現(xiàn)野生油蘑的人工栽培是現(xiàn)階段亟待解決的問題。

目前對(duì)油蘑的研究主要集中在生態(tài)分布［1-2］、生境考察［3］等方面，而在其菌絲分離方面的研究較少［4］。本研究以在大慶市不同地區(qū)采集的野生油蘑為試驗(yàn)材料，選取子實(shí)體不同部位進(jìn)行組織分離培養(yǎng)，對(duì)得到的菌種進(jìn)行純化，為下一步利用rDNA ITS區(qū)段對(duì)菌絲體進(jìn)行物種鑒定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為明確大慶市野生油蘑的菌種類別，實(shí)現(xiàn)野生油蘑的人工栽培提供技術(shù)指導(dǎo)，同時(shí)為日后野生油蘑的深入研究和開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1子實(shí)體

野生油蘑子實(shí)體中等至較大。菌蓋直徑3～12 （15）cm，扁半球形，邊緣內(nèi)卷，波狀，黏，淺紅褐色，趨向邊緣色淺，被細(xì)小的棕褐色鱗片，氣味香，菌肉較厚，污白色，傷處變暗。菌褶密，較窄，污白色，不等長，傷處色較暗，菌柄較為粗壯，內(nèi)實(shí)至松軟，長4～8cm，粗1～3.5cm，有的下部膨大，孢子印白色。孢子卵圓形至近球形，光滑，無色，5.6～7.6（8）μm×3.5～5.4μm。秋季在楊樹林中沙質(zhì)的土地上群生、散生。1.1.2培養(yǎng)基

A.馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 （PDA）：葡萄糖20.0g，馬鈴薯200.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1 000.0mL，pH值自然。

B.孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.5g，瓊脂20g，1/3000孟加拉紅溶液100mL，蒸餾水1 000mL，氯霉素0.1g。

C.PDA+VB1+VB3培養(yǎng)基（PVB）：葡萄糖20.0g，馬鈴薯200.0g，VB10.5mg，VB30.5mg，瓊脂20.0g，蒸餾水1 000.0mL，pH值自然。

D.PDA+楊樹樹葉浸泡液：葡萄糖20.0g，馬鈴薯200.0g，瓊脂20.0g，楊樹樹葉浸泡液1 000.0mL，pH值自然。

1.1.3儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)、生化培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、電爐、酒精燈、接種環(huán)等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基配制

按上述配方配制三種培養(yǎng)基，置高壓滅菌鍋滅菌30min。滅菌后，用直徑為90mm的培養(yǎng)皿分裝。

1.2.2組織分離

1.2.2.1子實(shí)體表面消毒后分離

在超凈工作臺(tái)上，取子實(shí)體用75%的酒精棉球擦洗表面，用無菌水沖洗后，分別將菌柄、菌柄與菌蓋交界處、菌蓋組織等三個(gè)不同部位切割成黃豆粒大小塊，在酒精燈火焰邊接入各培養(yǎng)基中。

1.2.2.2子實(shí)體直接分離

新鮮野生油蘑子實(shí)體若干，置于超凈工作臺(tái)上，打開紫外線燈照射30min后，用酒精棉球擦拭雙手，在酒精燈火焰旁，用無菌解剖刀分別切取菌柄內(nèi)部、菌柄與菌蓋交界處內(nèi)部、菌蓋內(nèi)部各黃豆粒大小組織塊，分別接入4種培養(yǎng)基上，每一子實(shí)體不同部位組織塊分別接入4種培養(yǎng)基。然后置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)25℃下黑暗培養(yǎng)，每天定時(shí)觀察，記錄不同組織塊在不同培養(yǎng)基內(nèi)的定植萌發(fā)及菌絲生長情況［5］。

2　結(jié)果與分析

2.1子實(shí)體表面消毒后分離對(duì)黑龍江省大慶市野生油蘑子實(shí)體的菌柄、菌柄與菌蓋交界處、菌蓋組織分別進(jìn)行組織分離。由表1中可以看出菌蓋組織塊在培養(yǎng)25d后，開始萌發(fā)，長出白色菌絲，平均萌發(fā)率為10%。其中，PDA+楊樹樹葉浸泡液的培養(yǎng)基中菌蓋組織的平均萌發(fā)率最高，可達(dá)到20%；在PDA+VB1+VB3培養(yǎng)基（PVB）中，菌蓋組織的萌發(fā)率較低，只有5%；PDA培養(yǎng)基最不適宜油蘑子實(shí)體菌絲的培養(yǎng)，基本不萌發(fā)。子實(shí)體的菌柄以及菌柄與菌蓋交界處在四種培養(yǎng)基中均不萌發(fā)，不適宜作為油蘑子實(shí)體組織分離培養(yǎng)的對(duì)象。

表1　子實(shí)體菌絲的萌發(fā)狀況Tab.1 Mycelium germination of fruiting body

2.2子實(shí)體表面未經(jīng)消毒直接分離

表2　子實(shí)體菌絲的萌發(fā)狀況Tab.2 Mycelium germination of fruiting body

由表2中可以看出菌蓋組織塊在培養(yǎng)27d后，開始萌發(fā)，長出白色菌絲，平均萌發(fā)率為3.75%。其中PDA+楊樹樹葉浸泡液的培養(yǎng)基中菌蓋組織的萌發(fā)率最高，可達(dá)到10%，在孟加拉紅培養(yǎng)基培養(yǎng)基中菌蓋組織的萌發(fā)率為5%，而在PDA培養(yǎng)基和PDA+VB1+VB3培養(yǎng)基（PVB）中，菌蓋組織不萌發(fā)菌絲，均不適宜油蘑子實(shí)體菌蓋組織的培養(yǎng)。

子實(shí)體的菌柄以及菌柄與菌蓋交界在四種培養(yǎng)基中均無菌絲萌發(fā)。

3　結(jié)論

3.1樹葉浸泡液對(duì)油蘑菌絲萌發(fā)的影響

在PDA培養(yǎng)基中加入楊樹樹葉浸泡液后，提高了菌蓋組織菌絲的萌發(fā)率?？梢缘贸鰲顦錁淙~浸泡液中含有促進(jìn)油蘑菌絲萌發(fā)的成分，其具體成分含量及比例，有待于進(jìn)一步的研究。

3.2子實(shí)體表面消毒對(duì)油蘑蘑菌絲萌發(fā)的影響

從以上兩個(gè)表中數(shù)據(jù)可得出，在PDA+楊樹樹葉浸泡液培養(yǎng)基中，對(duì)子實(shí)體表面進(jìn)行消毒后菌絲萌發(fā)率可達(dá)20%，而未經(jīng)消毒的子實(shí)體菌絲萌發(fā)率只有10%。在孟加拉紅培養(yǎng)基中，對(duì)子實(shí)體表面進(jìn)行消毒后菌絲萌發(fā)率可達(dá)15%，而未經(jīng)消毒的子實(shí)體菌絲萌發(fā)率只有5%，由此可見對(duì)子實(shí)體表面消毒可促進(jìn)油蘑菌絲的萌發(fā)。

［1]何紹昌.貴州林木外生菌根種類及生態(tài)分布的初步研究［J］.貴州科學(xué)，1991，9（1）：51-58.

［2]趙友春，馬啟明.山東省的菌根真菌及其分布［J］.生態(tài)學(xué)雜志，1990，9（6）：56-58.

［3]弓明欽.海南島尖峰嶺地區(qū)大型真菌考查報(bào)告［J］.林業(yè)科學(xué)研究，1988，3 （1）：90-97.

［4]吳珂.野生楊口蘑茵絲分離試驗(yàn)［J］.食用菌，2008，（03）：22-24.

［5]張功，侯枝蓮.三種菇子實(shí)體不同部位組織分離培養(yǎng)菌絲生長研究［J］.中國食用菌，2001，20（2）：9-10.

Studies on the Isolation，Purification of Tricholoma populinum

PANGJing，GUOMeng-qiao，LIUWei-wei
（Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing 163319，China）

In this paper，Tricholoma populinumJ.Lange which was collected in different areas of Daqing was selected as the experimental material.Different parts of the fruiting body was isolated and purified.The germination conditions of fruiting body under different culture medium was studied.The results showed that PDA+poplar leaves liquid culture medium was the most suitable culture medium for mycelium germination. Whether the surface offruitingbodywas disinfected had a great influenceon myceliumgrowth.

Tricholoma populinum；Isolation；Purification

S646

A

1674-8646（2015）07-0016-02

2015-05-13

潘靜（1987-），女，黑龍江哈爾濱人，學(xué)士，研究實(shí)習(xí)員，從事花卉、食用菌研究。