Ku70蛋白在肝細(xì)胞癌患者體內(nèi)的表達(dá)規(guī)律及其意義

楊成林，李俊杰，孫學(xué)軍

在世界范圍內(nèi)肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)死亡率在腫瘤中列第3位［1］。提高早期診斷是提升HCC療效的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的超聲、CT和MRI敏感性不夠或價(jià)格昂貴，無法準(zhǔn)確或大規(guī)模應(yīng)用于其早期診斷或預(yù)后判斷［2-3］。甲胎蛋白(a-Fetoprotein，AFP)是敏感性和特異性均較高的HCC血清標(biāo)志物，但仍有30%患者血清AFP并未升高，因而臨床應(yīng)用有局限性［4］。在非小細(xì)胞型肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、胃癌、胰腺癌、食管癌等組織及細(xì)胞系中，均發(fā)現(xiàn)有Ku70異常表達(dá)［5-13］。Ku80與乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)相關(guān)的HCC預(yù)后有密切關(guān)系［14-15］。但Ku70蛋白在HCC中的表達(dá)規(guī)律及其臨床意義相關(guān)報(bào)道較少。因此，本研究收集106例HCC手術(shù)切除標(biāo)本，檢測(cè)Ku70蛋白在HCC患者體內(nèi)的表達(dá)規(guī)律，并明確其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2005年1月—2011年5月我院手術(shù)治療的106例HCC手術(shù)切除標(biāo)本及臨床資料。所有患者術(shù)后病理檢查均為原發(fā)性HCC，且手術(shù)切緣無殘存腫瘤細(xì)胞。其中男69例，女37例，年齡26～75(57.7±19.1)歲，中位年齡55歲。肝硬化98例、乙型病毒性肝炎95例、丙型病毒性肝炎7例、酒精性肝病4例;感染HBV時(shí)間49例＜10年，46例≥10年。肝癌分期I期34例，II期38例，III期27例，IV期7例。術(shù)前Child-Pugh分級(jí)A級(jí)66例，B級(jí)40例。病理高分化31例，中分化46例，低分化29例。隨機(jī)收集92例肝血管瘤手術(shù)時(shí)切取的正常肝組織作為正常對(duì)照組，其中男56例，女36例，年齡(53.1±22.6)歲。兩組患者的年齡及性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 標(biāo)本收集與處理 通過肝癌根治術(shù)取癌組織和距離癌組織2 cm的癌旁組織。浸泡在4%甲醛溶液中固定24 h，而后常規(guī)石蠟包埋、切片，切片厚度4 μm。所有受試者均簽署書面知情同意書，并由醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 隨訪 隨訪采取門診復(fù)查或電話。隨訪截止日期為2014年6月30日。隨訪周期為2～88(47.3±31.5)個(gè)月，中位時(shí)間為42個(gè)月。失訪3例，其中男2例，女1例，均為HBV相關(guān)的HCC合并肝硬化。最終103例完成隨訪。每月檢查AFP水平;每6個(gè)月行腹部B超檢查。如果懷疑腫瘤復(fù)發(fā)，立即行CT和MRI檢查確診。

1.4 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定 以PBS代替一抗作為空白對(duì)照，以正常兔血清(武漢博士德生物工程有限公司)代替一抗作為陰性對(duì)照，采用鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連接(SP)法染色?？乖迯?fù)液為0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)。切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2－甲醇溶液浸泡10 min，抗原微波熱修復(fù)2～3次;山羊血清封閉10 min，加一抗(anti-Ku70單克隆抗體，美國Abcam公司)后置于4℃過夜;37℃復(fù)溫45 min后加入二抗，37℃下孵育30 min，DAB顯色5～10 min，蘇木精襯染后脫水、透明、封片;普通光鏡下觀察結(jié)果。由兩名高年資病理科醫(yī)師在不知道任何臨床和病理資料的情況下判讀結(jié)果。Ku70蛋白的陽性效應(yīng)產(chǎn)物為定位于細(xì)胞核的棕黃色顆粒［7］，細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈現(xiàn)為輕度或陰性免疫反應(yīng)。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，各計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。觀察細(xì)胞著色程度，未染色計(jì)0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。計(jì)算陽性細(xì)胞的百分比，＜5%為0分，6% ～25%為1分，25% ～50%為2分，51% ～75%為3分，76% ～100%為4分。兩個(gè)得分相乘作為Ku70蛋白表達(dá)結(jié)果:陰性0分、弱陽性1～4分、陽性5～8分、強(qiáng)陽性9～12分，陽性率(%)=［1－(陰性表達(dá)例數(shù)/總例數(shù))］×100%。根據(jù)最終的結(jié)果，定義0～4分低表達(dá)，5～12分高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩樣本之間的比較采用Student＇s t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。多因素分析采用非條件Logistic回歸分析。Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，組間比較采用log-rank檢驗(yàn)，α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 組織標(biāo)本中Ku70蛋白的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Ku70蛋白的陽性表達(dá)信號(hào)主要位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒狀，染色均勻一致。在肝癌組織中，Ku70蛋白的陰性表達(dá)率為9.7%(10例)，弱陽性表達(dá)率為27.2%(28 例)、陽性表達(dá)率為37.9%(39 例)、強(qiáng)陽性表達(dá)率為25.2%(26例)，總的陽性表達(dá)率為90.3%。癌旁組織中，Ku70蛋白的陰性、弱陽性、陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為30.1%(31例)、31.1%(32 例)、24.3%(25 例)和 14.5%(15 例)，總的陽性表達(dá)率為69.9%。92例正常肝組織中，Ku70蛋白的陰性、弱陽性、陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)率分別為31.5%(29 例)、35.9%(33 例)、22.8%(21 例)和9.8%(9例)，總的陽性表達(dá)率為68.5%。與正常肝組織比較，肝癌組織和癌旁組織中Ku70蛋白的陽性、強(qiáng)陽性和總的陽性表達(dá)率均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與癌旁組織比較，肝癌組織中Ku70蛋白的陽性、強(qiáng)陽性和總的陽性表達(dá)率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 肝癌組織中Ku70蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 根據(jù)Ku70蛋白的表達(dá)情況，將103例HCC患者分為低表達(dá)組38例(36.9%)和高表達(dá)組65例(63.1%)。單因素分析表明，肝癌組織中Ku70蛋白的表達(dá)水平與Child-Pugh分級(jí)、腫瘤直徑、腫瘤分化程度及 TNM分期有關(guān)(P=0.021、0.039、0.017、0.008)，見表 1。將上述單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)進(jìn)行非條件Logistic回歸分析。Y=0為Ku70低表達(dá)，Y=1為Ku70高表達(dá)。變量賦值如下:Child A級(jí)=0，Child B級(jí)=1;腫瘤大小:腫瘤直徑＜2 cm為1，2～5 cm為2，＞5 cm為3;腫瘤低分化=1，中分化=2，高分化=3;I期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期 =3，Ⅳ期 =4。結(jié)果表明，Child-Pugh分級(jí)、腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期是HCC患者肝癌組織中Ku70蛋白表達(dá)水平升高的危險(xiǎn)因素，見表2。

2.3 Ku70蛋白的表達(dá)水平與生存情況的關(guān)系 低表達(dá)組生存時(shí)間為(40.3±4.6)個(gè)月，中位生存時(shí)間為33個(gè)月，3年生存率為47.4%，5年生存率為21.1%;高表達(dá)組生存時(shí)間為(30.8 ±2.6)個(gè)月，中位生存時(shí)間為25個(gè)月，3年生存率為27.7%，5年生存率為7.3%。與高表達(dá)組比較，低表達(dá)組患者的生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P＜0.05)。

表1 肝癌組織Ku70蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

表2 影響肝癌組織中Ku70蛋白表達(dá)水平危險(xiǎn)因素的分析

3 討論

除AFP外，細(xì)胞間黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、γ-凝血酶原 (Desgamma carboxy-prothrombin，DCP)、人凝血酶原前體蛋白(Protein-induced vitamin K absence or antagonistII，PIVKA-II)、骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)等均被發(fā)現(xiàn)與HCC患者的預(yù)后有密切關(guān)系，但單獨(dú)應(yīng)用時(shí)，敏感性和特異性仍較為有限［16-19］。在AFP的基礎(chǔ)上，聯(lián)合其他分子標(biāo)志物檢測(cè)，是提高HCC診斷和預(yù)后判斷準(zhǔn)確率的可行方法［20］。

Ku70在修復(fù)DNA并維持基因組穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)，Ku70的生物學(xué)功能十分復(fù)雜，參與多種基因的表達(dá)與調(diào)控，與腫瘤的形成有密切關(guān)系［21］。Hu等［7］發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌組織中，Ku70的表達(dá)顯著升高;而高表達(dá)Ku70的患者，其臨床分期較晚，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例較高，且生存時(shí)間較短。Alshareeda等［22］報(bào)道Ku70表達(dá)與乳腺癌患者較差的預(yù)后、較低的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。Ku70與消化系統(tǒng)腫瘤也存在類似的關(guān)系。Gasinska等［8］發(fā)現(xiàn)Ku70與女性結(jié)腸癌患者的TNM分期有關(guān)，表達(dá)水平越高TNM分期越高。Li等［11］發(fā)現(xiàn)與正常胃組織相比，胃癌組織中Ku70的陽性表達(dá)率顯著升高。Sullivan等［12］發(fā)現(xiàn)在胰腺導(dǎo)管腺癌的腫瘤組織中，Ku70呈高表達(dá)趨勢(shì)，且通過RNA干擾下調(diào)Ku70的表達(dá)，可顯著降低胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞系 Mia PaCa-2的侵襲性。Yang等［13］發(fā)現(xiàn)Ku70與食管癌患者較差的預(yù)后、較高的TNM分期、較低的分化等級(jí)有直接關(guān)系;而在細(xì)胞水平中下調(diào)Ku70的表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。這些研究均表明，Ku70與消化系統(tǒng)腫瘤有著密切的聯(lián)系，其可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮類似原癌基因的功能。近期亦有研究表明，與Ku70共同組成Ku蛋白的另一條多肽鏈Ku80，與HBV和HCV相關(guān)的HCC患者預(yù)后有密切關(guān)系［14-15］。但Ku70蛋白在HCC中的表達(dá)規(guī)律及其臨床意義相關(guān)研究報(bào)道較少。

因此，本研究首先檢測(cè)HCC患者手術(shù)切除標(biāo)本中Ku70蛋白的表達(dá)情況，以確定Ku70與HCC的關(guān)系。與已有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相似，我們發(fā)現(xiàn)Ku70蛋白在肝癌組織中呈高表達(dá)趨勢(shì)，且陽性結(jié)果出現(xiàn)于癌細(xì)胞的細(xì)胞核中。生理情況下，Ku70在DNA的損傷修復(fù)起重要作用，維持基因組的穩(wěn)定性;而在腫瘤的發(fā)展過程中，DNA復(fù)制往往出現(xiàn)損害，Ku70表達(dá)有可能出現(xiàn)反應(yīng)性增高，在肝癌組織中表達(dá)升高，而在癌旁和正常肝組織中表達(dá)量較低甚至是陰性。在臨床病理指標(biāo)檢測(cè)中，通過單因素和非條件Logistic統(tǒng)計(jì)分析，明確Ku70蛋白的表達(dá)增高，與術(shù)前較差的肝功能、較大的腫瘤直徑以及較高的TNM分期有關(guān);而進(jìn)一步的生存分析還表明，Ku70高表達(dá)的患者，其生存情況亦較差。至此初步明確Ku70蛋白的表達(dá)提示了HCC的惡性進(jìn)展程度，與肝癌細(xì)胞的增殖可能有一定的相關(guān)性。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)Ku70蛋白是HCC診斷的潛在腫瘤標(biāo)志物，對(duì)接受手術(shù)治療的HCC患者的預(yù)后判斷有較好的應(yīng)用價(jià)值，是一個(gè)具有良好潛在應(yīng)用前景的分子標(biāo)志物。

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