乳腺癌NOEY2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的研究

劉秀娟，高 靜，姜英翰，潘鑫艷，黎貴蕓，陳 玥，楊舉倫

腫瘤抑制基因NOEY2又名ras同源基因家族成員Ⅰ或ARHI，是母源性印跡、父源性表達(dá)的抑癌基因［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)NOEY2 mRNA的低表達(dá)或缺失與卵巢癌、胰腺癌的發(fā)生有關(guān)［3］。本實(shí)驗(yàn)室前期曾在乳腺癌發(fā)生模型MCF10的增生細(xì)胞系、癌前細(xì)胞系、導(dǎo)管內(nèi)癌細(xì)胞系和浸潤(rùn)癌細(xì)胞系中檢測(cè)到NOEY2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島Ⅰ高度甲基化及相應(yīng)的mRNA表達(dá)減少，提示NOEY2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與乳腺癌發(fā)生有關(guān)［4］。通過(guò)免疫組化和原位雜交法，Wang等［5］在正常乳腺組織中檢測(cè)到NOEY2表達(dá)，而在乳腺浸潤(rùn)癌(70%)和導(dǎo)管原位癌(41%)中表達(dá)下降。之前乳腺癌中關(guān)于NOEY2甲基化及其mRNA表達(dá)的研究主要集中在細(xì)胞系，而實(shí)體乳腺癌組織的研究局限于NOEY2 mRNA及其蛋白的表達(dá)，并未同時(shí)進(jìn)行NOEY2甲基化狀態(tài)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)用甲基化特異性PCR(methylationspecific PCR，MSP)技術(shù)檢測(cè)乳腺增生和乳腺癌中抑癌基因NOEY2啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC)中NOEY2 mRNA表達(dá)，探討NOEY2基因甲基化與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源:收集成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院2010年1月—2012年1月手術(shù)切除乳腺的女性患者標(biāo)本，其中 IDC組46例，平均年齡44歲，腫瘤直徑(3.4±1.5)cm;乳腺普通型導(dǎo)管增生(UDH)組30例，平均年齡46歲;癌旁正常乳腺組織(NBT)組20例，平均年齡42歲;存檔蠟塊中的乳腺原位導(dǎo)管癌(DCIS)組20例，平均年齡49歲，腫瘤直徑(3.0±1.7)cm;乳腺非典型導(dǎo)管增生(ADH)組13例，平均年齡47歲，腫瘤直徑(2.5±1.3)cm。IDC臨床分期:Ⅰ期10例，Ⅱ期31例，Ⅲ期5例;組織學(xué)分級(jí):Ⅰ級(jí)17例，Ⅱ級(jí)24例，Ⅲ級(jí)5例;腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例;人表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)陽(yáng)性10例;雌激素受體(ER)陽(yáng)性26例;孕激素受體(PR)陽(yáng)性19例。新鮮標(biāo)本在手術(shù)切除后放于液氮中速凍，之后置于－80℃低溫冰箱中保存。石蠟標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋。上述標(biāo)本均經(jīng)病理醫(yī)師檢查驗(yàn)證和歸類(lèi)(圖1～4)。

圖2 非典型導(dǎo)管增生(HE×100)

圖3 導(dǎo)管原位癌(HE×100)

圖4 浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(HE×100)

1.1.2 主要試劑:T4連接酶、BamH I酶、Sal I酶購(gòu)自Fermentas公司;QIAamp DNA FFPE Tisuue Kit、EpiTect Bisulfite Kit購(gòu)自QIAGEN公司;D2000 DNA marker、基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取:按照天根公司DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取新鮮冰凍組織DNA，按照QIAGEN公司QIAamp DNA FFPE Tissue Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)提取石蠟組織基因組DNA。用紫外分光光度儀檢測(cè)提取DNA的含量和純度。

1.2.2 MSP

1.2.2.1 DNA的亞硫酸氫鹽修飾:將樣本基因組DNA和用M.SssI酶(CpG甲基轉(zhuǎn)移酶)處理并沉淀的人外周血單個(gè)核細(xì)胞基因組DNA分別進(jìn)行亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，取2 μg DNA于熱循環(huán)儀中進(jìn)行亞硫酸轉(zhuǎn)化，程序?yàn)?95℃、5 min;60℃、25 min;95℃、5 min;60℃、85 min;95℃、5 min;60℃、175 min，經(jīng)此反應(yīng)，DNA中甲基化的胞嘧啶不變，未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，后經(jīng)脫鹽、脫磺酸純化、洗脫，收集 DNA，修飾后樣品于 －20℃避光存儲(chǔ)，以進(jìn)行后續(xù)的MSP反應(yīng)。

1.2.2.2 MSP擴(kuò)增:NOEY2 CpGⅠ甲基化引物(M)和非甲基化引物(U)序列參考文獻(xiàn)［4］，甲基化引物序列為正鏈:5'-GTATTCGTCGTTAGGCGTTT-3'，反鏈:5'-CGAAACTTTCGTTATTCTTCGC-3'，產(chǎn)物大小為300 bp;非甲基化引物序列為正鏈:5'-AATGTTTGGTAGGTGGTGGTG-3'，反 鏈:5'-CCTCACCAAACCCTCACAAAA-3'，產(chǎn)物大小為225 bp。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系為25 μl，在 Ependoff熱循環(huán)儀中按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增:95℃預(yù)變性 5 min，95℃ 變性 30 s，59℃(TM)/57℃(TU)退火45 s，72℃延伸 40 s，擴(kuò)增 35 個(gè)循環(huán)之后，PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描觀察產(chǎn)物。若只產(chǎn)出甲基化產(chǎn)物，說(shuō)明此樣本目的DNA發(fā)生了甲基化;若只產(chǎn)出非甲基化產(chǎn)物，則此樣本目的DNA未發(fā)生甲基化;若甲基化和非甲基化產(chǎn)物同時(shí)存在，說(shuō)明此樣本DNA發(fā)生部分甲基化。PCR陰性對(duì)照:未經(jīng)M.SssI處理的健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA;陽(yáng)性對(duì)照:經(jīng)M.SssI處理的健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA。

1.2.2.3 基因甲基化水平的積分光密度(IOD)判定:使用Quantity One軟件測(cè)定甲基化條帶(M)和非甲基化條帶(U)的 IOD，通過(guò)計(jì)算 IODM/(IODM+IODU)，判定NOEY2基因的甲基化水平。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NOEY2基因mRNA表達(dá)水平:從46例IDC中隨機(jī)抽取30例，提取新鮮乳腺組織總RNA，用RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，以cDNA為模板對(duì)NOEY2基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。NOEY2基因引物序列參考文獻(xiàn)［4］，序列為正鏈:5'-CCGAGCAGCGCATTTGTCTT-3'，反 鏈:5'-CGATGGGGAACTTATGCAGGTT-3'， 產(chǎn) 物 大 小558 bp;內(nèi)參基因GAPDH引物由Primer 5設(shè)計(jì)，序列為正鏈:5'-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3'，反鏈:5'-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3'，產(chǎn) 物 大 小108 bp，引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在BIO-RAD CFX96TMReal-time System中進(jìn)行。每個(gè)樣本重復(fù)3次，取其平均值，基因的相對(duì)表達(dá)量以2-△△CT值表示。反應(yīng)體系為15 μl，運(yùn)行程序?yàn)?95℃ 預(yù)變性 5 min，95℃、10 s，60℃、20 s，72℃、20 s，78℃、20 s，讀板，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，95℃、30 s，60℃、30 s，Melt Curve 65 ～ 95℃:increment 0.5、5 s。內(nèi)參 GAPDH 做樣本內(nèi)校正，NBT做對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料以中位數(shù)±四分位間距(M±Q)表示;應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)甲基化率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;應(yīng)用秩和檢驗(yàn)對(duì)甲基化水平和基因表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;采用Spearman等級(jí)相關(guān)方法分析甲基化水平和基因表達(dá)量的相關(guān)性;χ2檢驗(yàn)分析NOEY2基因甲基化與乳腺癌患者的年齡、腫瘤大小、臨床分期、組織學(xué)分級(jí)等臨床病理參數(shù)的關(guān)系。α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 NOEY2基因啟動(dòng)子甲基化率 甲基化特異性PCR結(jié)果顯示，未經(jīng)M.SssI處理的健康人外周血DNA同時(shí)擴(kuò)增出甲基化和非甲基化產(chǎn)物;經(jīng)M.SssI處理的健康人外周血DNA僅擴(kuò)增出甲基化產(chǎn)物。NBT組、UDH組、ADH組、DCIS組和IDC組完全甲基化率分別為 0、6.7%、15.4%、20.0%、32.6%。IDC組與NBT組、UDH組組間的甲基化率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.440，P=0.004;χ2=7.037，P=0.008)，部分MSP結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 乳腺浸潤(rùn)癌NOEY2基因啟動(dòng)子甲基化MSP分析

2.2 NOEY2基因啟動(dòng)子甲基化水平 NOEY2基因的甲基化水平 IDC組為0.546±0.297，DCIS組為0.299 ±0.496，ADH 組為0.270 ±0.336，UDH 組為0.251 ±0.327，NBT 組為 0.178 ±0.239，各組間甲基化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 NOEY2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島Ⅰ基因啟動(dòng)子甲基化與IDC臨床病理參數(shù)的關(guān)系 46例IDC標(biāo)本中NOEY2 CpG島Ⅰ完全甲基化15例，其與患者的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期有關(guān)(P＜0.05)，而與年齡、腫瘤大小、ER表達(dá)、PR表達(dá)、HER2擴(kuò)增無(wú)相關(guān)性(P ＞0.05)，見(jiàn)表1。

2.4 NOEY2 mRNA在IDC中的表達(dá) 30例IDC標(biāo)本中完全甲基化組(9例)NOEY2 mRNA表達(dá)量為0.076 ±0.091，部分甲基化組(21 例)NOEY2 mRNA 表達(dá)量為 0.733 ±1.597，完全甲基化組NOEY2 mRNA表達(dá)量低于部分甲基化組，經(jīng)秩和檢驗(yàn)，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022)。21例部分甲基化標(biāo)本中有7例NOEY2 mRNA表達(dá)近乎缺失。

2.5 IDC中NOEY2基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與mRNA表達(dá)量的關(guān)系 NOEY2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島Ⅰ甲基化水平與其mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r= －0.659，P ＜0.05)。

表1 乳腺浸潤(rùn)癌NOEY2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島Ⅰ完全甲基化與臨床病理參數(shù)的關(guān)系(n=46)

3 討論

乳腺癌的發(fā)生包括基因的遺傳學(xué)改變和表觀遺傳學(xué)改變。表觀遺傳學(xué)改變是指DNA序列不改變的前提下，通過(guò)某些機(jī)制引起的基因表達(dá)或細(xì)胞表現(xiàn)型的變化，發(fā)生在轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程，具有遺傳性和可逆性［6］。而DNA甲基化是目前研究最清楚、最重要的表觀遺傳修飾形式。癌基因的去甲基化可導(dǎo)致癌基因激活，抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄沉默而表達(dá)減少［7］。此外，具有腫瘤抑制功能的miRNA在乳腺腫瘤細(xì)胞中也通過(guò)高甲基化失活［8］。乳腺癌中常發(fā)生甲基化的基因有 ER［9］，PR［10］，BRCA1［11］， E-cadherin［12］， P16INK4a/CDKN2A/MTS［13-14］，RARβ2 等［15］。

人NOEY2基因定位于1p31，長(zhǎng)約8 kb，包括位于啟動(dòng)子區(qū)的CpG島Ⅰ，跨越啟動(dòng)子和第1個(gè)外顯子的CpG島Ⅱ以及位于第2個(gè)外顯子內(nèi)的CpG島Ⅲ［2］。NOEY2參與細(xì)胞周期調(diào)控和信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)［1］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)NOEY2基因突變與乳腺癌發(fā)生相關(guān)，從遺傳學(xué)角度探討了NOEY2基因失活導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生的機(jī)制，但尚有部分乳腺癌NOEY2表達(dá)缺失難以單純用基因突變來(lái)解釋?zhuān)崾居衅渌麢C(jī)制導(dǎo)致NOEY2失活［16］。本實(shí)驗(yàn)將 NBT、UDH、ADH、DCIS 及 IDC納入研究對(duì)象，在表觀遺傳學(xué)層面，研究實(shí)體乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有關(guān)NOEY2基因的甲基化及其表達(dá)的作用。

本研究結(jié)果顯示NBT、UDH、ADH、DCIS及IDC中NOEY2啟動(dòng)子區(qū)CpG島Ⅰ的完全甲基化率分別為0、6.7%、15.4%、20.0%、32.6%，呈升高趨勢(shì)。由于NOEY2母源性等位基因甲基化印跡機(jī)理，用MSP法檢測(cè)正常乳腺組織呈部分甲基化狀態(tài)。乳腺癌NOEY2完全甲基化見(jiàn)于癌變的整個(gè)過(guò)程，且隨著病變進(jìn)展，完全甲基化率升高說(shuō)明NOEY2甲基化在乳腺癌發(fā)生過(guò)程中起作用。由于NOEY2母源性甲基化印跡基因的特殊性，正常部分甲基化和異常部分甲基化難以區(qū)分。為此，我們采用甲基化相對(duì)定量的方法，測(cè)定MSP結(jié)果的電泳條帶積分光密度并計(jì)算甲基化水平，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，UDH、ADH、DCIS、IDC和NBT的甲基化水平比較無(wú)差異，但在這些標(biāo)本中檢測(cè)到5例IDC、3例DCIS和2例UDH的甲基化水平較高，均為正常表達(dá)水平的1.5倍以上，說(shuō)明這幾例部分甲基化標(biāo)本發(fā)生了異常甲基化。有研究顯示，14-3-3、cyclinD2［17］、ASSF1A、p16［18］基因的甲基化頻率和水平在乳腺癌發(fā)生的各階段中也在一定差異，表明特定乳腺癌相關(guān)基因的甲基化改變與乳腺癌發(fā)生有關(guān)［19］。

本研究發(fā)現(xiàn)，9例完全甲基化的乳腺浸潤(rùn)癌中NOEY2 mRNA表達(dá)水平低于21例部分甲基化的IDC標(biāo)本，且30例IDC中NOEY2基因的甲基化水平和其mRNA表達(dá)量存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明乳腺癌發(fā)生過(guò)程中NOEY2啟動(dòng)子區(qū)CpG島Ⅰ的異常甲基化是導(dǎo)致其表達(dá)失活的重要原因之一。進(jìn)一步結(jié)合臨床病理資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn):NOEY2啟動(dòng)子區(qū)CpG島Ⅰ完全甲基化與乳腺癌患者腫瘤的組織學(xué)分級(jí)、臨床分期相關(guān)，而與年齡、ER表達(dá)、PR表達(dá)、Her2的擴(kuò)增無(wú)關(guān)，這進(jìn)一步說(shuō)明NOEY2啟動(dòng)子區(qū)CpG島Ⅰ異常甲基化與乳腺癌的進(jìn)展相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，抽取的30例 IDC中有7例NOEY2啟動(dòng)子區(qū)CpG島Ⅰ并未發(fā)生完全甲基化，但NOEY2 mRNA表達(dá)近乎缺失，研究認(rèn)為除啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化可導(dǎo)致基因表達(dá)沉默外，編碼區(qū)的CpG島甲基化也能抑制基因的表達(dá)，并可發(fā)展至啟動(dòng)子區(qū)使之失活［20］。而本實(shí)驗(yàn)我們只檢測(cè)了NOEY2啟動(dòng)子區(qū)CpG島Ⅰ在乳腺癌中的甲基化狀態(tài)與NOEY2 mRNA表達(dá)之間的關(guān)系，CpG島Ⅱ、CpG島Ⅲ是否發(fā)生甲基化以及3個(gè)CpG島的甲基化狀態(tài)與NOEY2 mRNA表達(dá)之間有何相關(guān)性，都有待進(jìn)一步探索。

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