提高八味痛經(jīng)膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究

周建華等

[摘要] 目的 建立八味痛經(jīng)膠囊的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。 方法 采用TLC法對(duì)八味痛經(jīng)膠囊中當(dāng)歸、桂枝、牡丹皮、延胡索進(jìn)行鑒別，用HPLC法測定八味痛經(jīng)膠囊中的牡丹皮和白芍共同有效成分芍藥苷的含量。 結(jié)果 薄層色譜可鑒別出當(dāng)歸、桂枝、牡丹皮、延胡索的特征斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾；HPLC法測定芍藥苷0.2575～2.5750μg線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為98.98%，RSD=1.0%（n=6）。 結(jié)論 該方法簡便可靠，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可用于八味痛經(jīng)膠囊的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 八味痛經(jīng)膠囊；薄層色譜法；高效液相色譜法；芍藥苷；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

[中圖分類號(hào)] R286 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2015）13-28-05

[Abstract] Objective To establish quality standard for Baweitongjing Capsules. Methods Angelicae sinensis Radix， Cinnamomi Ramulus， Moutan Cortex， Corydalis Rhizoma were identified by TLC， and the content of Paeoniflorin in Moutan Cortex and Paeoniae Alba Radix was determined by HPLC. Results TLC could identify Angelicae sinensis Radix， Cinnamomi Ramulus， Moutan Cortex， Corydalis Rhizoma. Paeoniflorin showed a good linear relationship at a range of 0.2575-2.5750μg. The average recovery was 98.98%（n=6） and RSD was 1.0%. Conclusion The method is simple， accurate， high specificity， and with good repeatability. The method can be used for Baweitongjing Capsules quality control.

[Key words] Baweitongjing capsules； TLC； HPLC； Paeoniflorin； Quality standard

八味痛經(jīng)膠囊由牡丹皮、白芍、川牛膝等八味中藥組成，是根據(jù)《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編·中成藥地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)部分》外科、婦科分冊(cè)收載的八味痛經(jīng)片[1]，經(jīng)劑型改革研制而成。具有活血調(diào)經(jīng)，化瘀止痛的功效，用于經(jīng)行不暢，色紫成塊，行經(jīng)腹痛。為提供該藥品可行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，我們對(duì)其開展了試驗(yàn)研究，采用薄層色譜法對(duì)八味痛經(jīng)膠囊中當(dāng)歸、桂枝、牡丹皮、延胡索進(jìn)行鑒別；牡丹皮、白芍為處方中主要藥味，芍藥苷是其共同的有效活性成分，具有抗自由基損傷，抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載和抗神經(jīng)毒性等活性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明其有降低血液黏度、抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抗氧化、抗驚厥等多種生物學(xué)效應(yīng)，并且毒副作用較小[2]。目前報(bào)道芍藥苷的含量測定方法多為高效液相色譜法[3-13]，通過試驗(yàn)摸索和方法學(xué)研究，建立了HPLC法測定該制劑中芍藥苷的含量，提高了該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2996高效液相色譜儀；Waters 2996 PDA檢測器；Empower數(shù)據(jù)工作站。WD-9403C型紫外分析儀（北京市六一儀器廠），BYCDE-939薄層自動(dòng)鋪板器（重慶南岸貝爾德儀器技術(shù)廠），KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），定量毛細(xì)管（美國Drummond公司），BP211D電子天平（Sartorius）。

1.2 試藥

當(dāng)歸對(duì)照藥材、桂皮醛、丹皮酚、延胡索乙素等對(duì)照品，均購自中國藥品生物制品檢定所。八味痛經(jīng)膠囊（規(guī)格：0.31g/粒，江西汪氏藥業(yè)有限公司，批號(hào)080107、080108、080109、080128、080129、080130），芍藥苷對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110736-200423）。甲醇、乙腈均為色譜純，乙醚、丙酮等試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。硅膠G（薄層色譜用，青島海洋化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 當(dāng)歸的鑒別 取本品內(nèi)容物6g，研細(xì)，加乙醚20mL，加熱回流1h，放冷，濾過，濾液揮至1mL作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對(duì)照藥材0.5g，加乙醚20mL，同供試品溶液的制備方法制成對(duì)照藥材溶液。同時(shí)制備陰性對(duì)照溶液（按照處方中各藥味的比例和制法項(xiàng)規(guī)定制成缺當(dāng)歸的陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制備）。按中國藥典（一部）薄層色譜法（附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（9∶1）為展開劑，置展開劑預(yù)飽和10min的展開缸內(nèi)，展開約10cm，取出晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾。

2.1.2 桂枝的鑒別 取桂皮醛對(duì)照品，加乙醇適量制成每1mL含桂皮醛1μL的溶液作為對(duì)照品溶液。同時(shí)制備陰性對(duì)照溶液（按照處方中各藥味的比例和制法項(xiàng)規(guī)定制成缺桂枝的陰性樣品，再按2.1.1項(xiàng)下的供試品溶液的制備方法制備）。按中國藥典（一部）薄層色譜法（附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取2.1.1項(xiàng)下的供試品溶液以及上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（17∶3）為展開劑，置展開劑預(yù)飽和10min的展開缸內(nèi)，展開約13cm，取出晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液，置日光下檢視。供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。見圖2。

2.1.3 牡丹皮的鑒別 取丹皮酚對(duì)照品，加丙酮適量制成每1mL含丹皮酚1mg的溶液作為對(duì)照品溶液。同時(shí)制備陰性對(duì)照溶液（按照處方中各藥味的比例和制法項(xiàng)規(guī)定制成缺牡丹皮的陰性樣品，再按2.1.1項(xiàng)下的供試品溶液的制備方法制備）。按中國藥典（一部）薄層色譜法（附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取2.1.1項(xiàng)下的供試品溶液以及上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（7∶2∶1）為展開劑，置展開劑預(yù)飽和10min的展開缸內(nèi)，展開約10cm，取出晾干，噴以鹽酸酸性5%三氯化鐵乙醇溶液，于105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。

2.1.4 延胡索的鑒別 取本品內(nèi)容物3g，研細(xì)，加甲醇20mL，超聲處理20min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0mL使溶解，加氨試液調(diào)節(jié)pH值至9，用乙醚萃取3次，每次10mL，合并乙醚萃取液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解作為供試品溶液。另取延胡索乙素對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含延胡索乙素1mg的溶液作為對(duì)照品溶液。同時(shí)制備陰性對(duì)照溶液（按照處方中各藥味的比例和制法項(xiàng)規(guī)定制成缺延胡索的陰性樣品，再按供試品溶液的制備方法制備）。按中國藥典（一部）薄層色譜法（附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一用1%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板上，以正己烷∶三氯甲烷∶甲醇（15∶8∶2）為展開劑，置展開劑預(yù)飽和10min的展開缸內(nèi)，展開約11cm，取出晾干，置碘缸中熏至斑點(diǎn)顯色清晰，取出在空氣中揮盡板上吸附的碘后，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無干擾。

2.2 芍藥苷的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 采用Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動(dòng)相A（乙腈）、流動(dòng)相B（0.1%磷酸溶液）按表1進(jìn)行梯度洗脫；流速為1.0mL/min；柱溫為25℃；檢測波長為230nm；進(jìn)樣量為20μL。理論板數(shù)以芍藥苷峰計(jì)不低于2000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品10.3mg，置100mL量瓶中，加稀乙醇適量使溶解

并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品母液。精密量取對(duì)照品母液5mL，置10mL量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得（HPLC色譜圖見圖5）。

2.2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，密塞稱重，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30min，放冷，再稱重，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得（HPLC色譜圖見圖5）。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按照處方中各藥味的比例和制法項(xiàng)規(guī)定制成缺牡丹皮和白芍的陰性樣品，再按2.2.3項(xiàng)下的供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照溶液（HPLC色譜圖見圖5）。

2.2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.2項(xiàng)下的對(duì)照品母液2.5、5、10、15、20、25μL，注入液相色譜儀，測定其峰面積。以芍藥苷進(jìn)樣量x（μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程y=1331863x-17482.93，r=0.9999。表明芍藥苷進(jìn)樣量與峰面積在0.2575～2.5750μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積，RSD為0.7%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8h進(jìn)樣，按上述色譜條件測定，峰面積的RSD為0.5%，說明八味痛經(jīng)膠囊供試品溶液中芍藥苷在8h內(nèi)均穩(wěn)定。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)八味痛經(jīng)膠囊樣品（批號(hào)080107），按2.2.3項(xiàng)下的供試品溶液處理方法制備6份供試品溶液，進(jìn)行測定，計(jì)算含量，結(jié)果平均含量為3.0573mg/g，RSD為0.1%。

2.2.9 回收率試驗(yàn) 取已知含量的八味痛經(jīng)膠囊樣品（批號(hào)080107）6份，每份取樣0.25g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入芍藥苷對(duì)照品溶液（0.0309mg/mL）25mL，密塞稱重，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）30min，放冷，再稱重，用稀乙醇

3 討論

取芍藥苷對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，選取二極管陣列檢測器在210～400nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，測定芍藥苷在230.8nm波長處有一較大吸收，參照中國藥典（一部）白芍藥材項(xiàng)下規(guī)定[14]，選擇230nm作為本實(shí)驗(yàn)檢測波長。

曾考察過I.甲醇∶水（25∶75），II.乙腈∶0.1%磷酸溶液（15∶85），III.乙腈∶0.1%磷酸溶液（17∶83）這三種流動(dòng)相，但以乙腈∶0.1%磷酸溶液（17∶83）為流動(dòng)相，芍藥苷峰基線完全分離，對(duì)稱性好，分析時(shí)間適中，但芍藥苷峰后較長時(shí)間處有2～3個(gè)小峰，為了避免影響后面進(jìn)樣中芍藥苷峰，在芍藥苷峰采集完后采用梯度洗脫趕掉小峰，經(jīng)試驗(yàn)摸索，按本文中的色譜條件梯度洗脫較佳。

試驗(yàn)中對(duì)供試品溶液提取方法、提取溶劑、溶劑用量和提取時(shí)間分別進(jìn)行了考察，提取方法考察了加熱回流法和超聲提取法，結(jié)果表明超聲提取法較加熱回流法提取更完全，且操作方便，故選擇超聲提取法；提取溶劑考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、稀乙醇四種溶劑，結(jié)果表明稀乙醇較其他溶劑提取更完全，故選擇稀乙醇作為提取溶劑；溶劑用量考察了稀乙醇25、50、75mL三種用量，結(jié)果表明稀乙醇25mL提取已較完全，與稀乙醇50、75mL的結(jié)果無顯著差異，故選擇稀乙醇用量為25mL；提取時(shí)間考察了超聲提取15、30、45、60min，結(jié)果表明超聲提取30min已較完全，與超聲提取45、60min的結(jié)果無顯著差異，故選擇提取時(shí)間為30min。

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（收稿日期：2015-03-22）