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    硒—汞雙元素標記策略識別硒蛋白/多肽

    2015-09-11 07:01:14徐明楊利民王秋泉
    分析化學(xué) 2015年9期
    關(guān)鍵詞:多肽

    徐明 楊利民 王秋泉

    摘 要 提出并發(fā)展了一種基于電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)的雙元素標簽標記策略來選擇性識別和檢測硒蛋白/多肽,其中內(nèi)源元素硒(Se)作為硒蛋白/多肽分子的識別元素,外源元素汞(Hg)作為硒蛋白/多肽和含硒蛋白/多肽分子的區(qū)分元素。通過對硒代半胱氨酸(SeCys)和谷胱甘肽過氧化酶1(GPx1)兩種模型分子的研究,外源鄰羧基苯硫甲基汞(CH3Hg-THI)動態(tài)解離的CH3Hg+能夠選擇性標記硒代半胱氨酸殘基(SeCys)中硒醇基(-SeH),但不能標記含硒蛋白/多肽分子的硒代蛋氨酸殘基(SeMet)中的—SeCH3,進而依據(jù)Se和Hg的ICP-MS信號識別和檢測硒蛋白/多肽。本方法應(yīng)用于富硒酵母水溶性提取液的分析,結(jié)果表明,提取液中的硒蛋白/多肽能夠被有效識別和檢測,驗證了Se-Hg雙元素標簽標記策略的發(fā)展是ICP-MS識別和檢測硒蛋白/多肽的一種可行且優(yōu)越的途徑。

    關(guān)鍵詞 硒; 汞; 硒蛋白/多肽; 電感耦合等離子體質(zhì)譜

    1 引 言

    以內(nèi)源元素分析蛋白質(zhì)已有很長的歷史,130年前發(fā)明的凱氏定氮法(Kjeldahl method)就是利用檢測蛋白質(zhì)內(nèi)源元素氮進行蛋白質(zhì)分析的經(jīng)典范例[1]。近二十年來,隨著生命科學(xué)和分析技術(shù)的快速發(fā)展,針對生物分子(如蛋白質(zhì)和多肽)的新元素標簽標記研究策略和方法不斷涌現(xiàn),而且還在快速發(fā)展進程中[2]。具有優(yōu)異的元素分析能力(高的靈敏度和選擇性)的電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)與元素標簽策略的有機結(jié)合可以實現(xiàn)復(fù)雜生物體系中低豐度蛋白質(zhì)和多肽等生物分子的分析[3~5]。除了內(nèi)源元素標簽,通過人為標記外源元素標簽(如鑭系元素、Hg、Au等)的研究策略因可以進一步擴展研究范圍和彌補內(nèi)源元素標簽的不足,越來越受到重視[6~14]。但是,因為針對目標蛋白質(zhì)/多肽如何建立起內(nèi)源元素標簽和外源標記元素間的關(guān)系還有一定困難,目前報道的研究方法還多集中于單一利用內(nèi)源或外源元素,同時利用兩類元素標簽的研究工作還鮮有報道。內(nèi)源和外源雙元素標記識別策略的建立,需要滿足以下要求:(1)目標生物分子需要含有內(nèi)源性共價結(jié)合的標簽元素;(2)目標生物分子能夠被外源性元素標簽有效標記,并且所標記的外源元素標簽與內(nèi)源標簽元素應(yīng)發(fā)揮各自的識別、區(qū)分和檢測功能;(3)內(nèi)源和外源性元素標簽?zāi)軌蛲瑫r有效地被ICP-MS識別和檢測。

    在本課題組以前的研究工作中,不但利用內(nèi)源元素硒(Se)定量地研究了人血漿中的硒蛋白,而且利用外源元素汞(Hg)標簽對多種蛋白和多肽分子實現(xiàn)選擇性的標記和定量分析[14~19]。Se和Hg是一對典型的在生物體中會產(chǎn)生拮抗效應(yīng)的元素,并形成特定的硒汞化合物[20~22]。作為一類重要的生物分子,硒蛋白/多肽中Se以硒醇(—SeH)的形式存在于硒代半胱氨酸殘基中,這為外源的Hg標簽提供了一個理想的標記位點。利用這兩種元素作為內(nèi)源和外源元素標簽識別和檢測硒蛋白/多肽在理論上是可行的。本研究探討了利用外源Hg標簽標記硒蛋白/多肽的可能性,進而實現(xiàn)Se-Hg雙元素標記選擇性識別和檢測硒蛋白/多肽的目的。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    液相色譜-電噴霧質(zhì)譜(Esquire LC/ESI-IT-MS,德國布魯克公司);基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(Microflex LRF MALDI-TOF-MS,德國布魯克公司);SERIES 200液相色譜-ELAN DRC II電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS,鉑金埃爾默公司)。為了消除16O2+對32S+的干擾,在測定S時使用O2(99.999%,北京氦普北分氣體工業(yè)有限公司)將S在動態(tài)反應(yīng)池中氧化為SO(0.6 mL/min O2;RPQ 0.45),檢測32S16O+測定S的含量;監(jiān)測82Se+和202Hg+用于Se和Hg的測定。

    硒代胱氨酸(Seleno-DL-cystine, (SeCys)2),硒代蛋氨酸(L-Selenomethionine, SeMet),二硫蘇糖醇(Dithiol dithiothreitol, DTT),鄰羧基苯硫酚(Thiosalicylic acid, HOOCC6H4SH),2,5-二羥基苯甲酸(2,5-Dihydroxybenzoic acid)和谷胱甘肽過氧化物酶1(Glutathione peroxidase 1, GPx1)均購于美國Sigma-Aldrich 公司;氯化甲基汞(Methylmercuric chloride, CH3HgCl,德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司);富硒酵母(Sel-Plex,美國Alltech公司);用于尺寸排阻色譜的標準物Pyruvate kinase (237.0 kDa), Bovine serum albumin (66.5 kDa), Ovalbumin (44.3 kDa), Lysozyme (14.3 kDa) 和 Cobalamin (1.4 kDa)購自Sigma-Aldrich公司。其它試劑均為分析純以上的純度;高純水(18 MΩ cm,廈門大學(xué)薩本棟微機電中心)。

    2.2 實驗方法

    2.2.1 CH3Hg-THI標記硒蛋白/多肽 將相同摩爾的氯化甲基汞(CH3HgCl)與鄰羧基苯硫酚(HOOCC6H4SH)混合反應(yīng),獲得鄰羧基苯硫甲基汞CH3HgS-C6H4COOH(CH3Hg-THI, 4 mmol/L, pH 7.4),并于4℃保存。利用過量的二硫蘇糖醇(DTT)將硒代胱氨酸(10

    還原為硒代半胱氨酸(SeCys)。CH3Hg-THI(4 mmol/L, 0.2 mL)標記還原所得的SeCys。在緩沖溶液(20 mmol/L NH4COOCH3, pH 7.4)中37℃孵育1 h后,利用ESI-IT-MS進行分析標記產(chǎn)物。同時,作為對照,硒代蛋氨酸(SeMet)也按照上述過程進行處理分析。

    谷胱甘肽過氧化物酶1(GPx1)溶于緩沖液(20 mmol/L NH4COOCH3, pH 7.4)作為儲備液,并保存于

    分別與CH3HgCl和CH3Hg-THI(5 μL, 4 mmol/L)進行反應(yīng)(37℃, 1 h)。反應(yīng)結(jié)束后,使用SEC/ICP-MS (尺寸排阻色譜柱,Superdex 75 10/300 GL(GE Healthcare);流動相: 5 mmol/L Tris + 100 mmol/L NH3HCO3, pH 7.4; 流速: 0.75 mL/min)和RPLC/ESI-MS VP-ODS C18反相色譜柱(日本Shimadzu公司);流動相A: H2O, 0.05% TFA; 流動相B: Acetonitrile, 0.05% TFA; 流速: 150 μL/min; 洗脫梯度: 0~5 min, 1% B; 5~10 min, 1%~5% B; 10~20 min, 5%~10% B; 20~25 min, 10%~30% B; 25~40 min, 30% B)對標記產(chǎn)物進行分析。每兩次分析間隔,利用1% DTT清洗色譜柱30 min。反應(yīng)產(chǎn)物同時利用MALDI-TOF-MS進行分析。

    2.2.2 富硒酵母水溶性提取液的制備和分析 使用5 mL PBS緩沖液(1.4 mmol/L NaCl, 0.27 mmol/L KCl, 1 mmol/L Na2HPO4, 0.18 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)于4℃超聲萃取富硒酵母(0.5 g)5 min,于4℃以10000 r/min離心30 min 2次,收集上清液,得到富硒酵母水溶性提取液。于50 μL富硒酵母水溶性提取液樣品中加入CH3Hg-THI(5 μL, 4 mmol/L)進行標記。反應(yīng)產(chǎn)物使用PD minitrap G-10進行脫鹽處理后,利用SEC/ICP-MS和RPLC/ICP-MS進行檢測分析。ICP-MS測定(82Se+, 202Hg+和32S16O+)之前,串聯(lián)的UV檢測器(214 nm)對色譜流出物進行檢測。3 結(jié)果與討論

    3.1 雙元素標記原理

    如圖1a所示,在蛋白質(zhì)/多肽分子中,Se有兩種存在形式:硒代半胱氨酸(SeCys)和硒代蛋氨酸(SeMet),兩者與S的存在形式半胱氨酸(Cys)和蛋氨酸(Met)結(jié)構(gòu)相似。含有SeCys的蛋白/多肽被定義為硒蛋白/多肽,而含有SeMet的蛋白/多肽為含硒的蛋白/多肽,這兩類蛋白/多肽具有不同的生理功能[23]。硒蛋白/多肽的SeCys殘基中的-SeH可以與CH3Hg-THI動態(tài)離解出的CH3Hg+反應(yīng), 實現(xiàn)選擇性的Hg標記;含有SeMet的含硒蛋白/多肽因Se以-SeCH3的形式存在而不能與Hg反應(yīng)(圖1b)。另一方面,硒醇基-SeH的pKa=5.2低于巰基(-SH)的pKa=8.5大約3個數(shù)量級; 相比于-SH,-SeH活性更高,更易與CH3Hg+反應(yīng)[24,25]。只有被ICP-MS同時檢測到Se和Hg的信號又在ESI-IT-MS上呈現(xiàn)Se和Hg的特征同位素分布的分子才被認為是硒蛋白/多肽;而只檢測到Se或Hg的信號的分子可能是含硒蛋白/多肽或其它含Cys的蛋白/多肽 (圖1c和1d)。這樣就可以實現(xiàn)硒蛋白/多肽的特異性識別。

    圖1 內(nèi)源和外源Se-Hg雙元素標記策略識別硒蛋白和多肽

    Fig.1 Endogenous and exogenous Se-Hg dual-labeling strategy for recognizing selenoprotein/peptide

    3.2 CH3Hg-THI標記硒醇-SeH

    為了研究CH3Hg-THI能否選擇性的標記-SeH,首先用DTT還原硒代胱氨酸(SeCys)2得到硒代半胱氨酸SeCys,之后用CH3Hg-THI標記SeCys(圖2a)。實驗結(jié)果表明,通過改變(SeCys)2與DTT的摩爾比,成功地獲得SeCys(m/z 167.6)(圖2b);其在與CH3Hg-THI反應(yīng)后,SeCys的質(zhì)譜信號消失,同時出現(xiàn)了產(chǎn)物CH3Hg-SeCys的質(zhì)譜信號(m/z 404.6),而且其同位素分布(404.6(23.0%), 402.6(16.3%), 403.5(14.9%), 401.6(12.8%), 406.6(11.3%), 400.5(8.4%), 405.5(6.6%), 408.5(2.9%), 399.5(2.1%), 397.7(0.9%), 398.6(0.8%))與H2NCOOHCHCH2SeHgCH3的理論同位素分布一致(圖2c),證明SeCys中的-SeH被成功標記。作為對照,SeMet(m/z 197.9和394.8)質(zhì)譜信號在標記反應(yīng)前后并無變化,說明-SeCH3不能被CH3Hg-THI所標記。

    圖2 (a)硒代胱氨酸(SeCys)2的DTT還原和CH3Hg-THI標記SeCys反應(yīng);(b)利用DTT還原硒代胱氨酸(SeCys)2獲得硒代半胱氨酸SeCys的ESI-IT-MS質(zhì)譜圖;(c)CH3Hg-THI標記硒代半胱氨酸SeCys和硒代蛋氨酸SeMet的質(zhì)譜圖

    Fig.2 (a) Reduction of (SeCys)2 to SeCys by dithiol dithiothreitol (DTT) and labeling with CH3Hg-THI, (b) ESI-IT-MS of the reduction of (SeCys)2 to SeCys by DTT and (c) labelling of the SeCys and SeMet with CH3Hg+ dynamically released from CH3Hg-THI

    3.3 CH3Hg-THI標記硒蛋白GPx1

    本實驗選取了一種典型的硒蛋白GPx1作為模型分子,驗證CH3Hg-THI標記GPx1中-SeH反應(yīng)的可行性。GPx1是硒蛋白家族中的一個重要成員,它能夠有效清除生物體中的超氧自由基[26]。GPx1分子由4個Monomer組成,每個Monomer含有1個-SeH基團(SeCys52)和2個-SH基團[27]。作為對照,同時使用CH3Hg+和CH3Hg-THI分別對GPx1進行標記。結(jié)果表明,在生理溶液中直接使用CH3Hg+對GPx1進行標記時出現(xiàn)了白色的蛋白沉淀(圖3a),說明GPx1的分子構(gòu)象被破壞,導(dǎo)致其變性。SEC/ICP-MS的分析結(jié)果也表明溶液中殘存的CH3Hg+標記的GPx1的Se和Hg信號顯著降低(圖3b)。相比于直接使用CH3Hg+,CH3Hg-THI間接地動態(tài)釋放CH3Hg+[17],并與GPx1反應(yīng),在標記過程中不會導(dǎo)致GPx1變性(圖3a),這時SEC/ICP-MS可同時檢測到非常強的Se和Hg信號,說明GPx1成功地被CH3Hg-THI標記,并能在生理溶液中穩(wěn)定存在。

    利用SEC/ESI-IT-MS和MALDI-TOF-MS對標記后的GPx1進行了分析(如圖3c)。SEC/ESI-IT-MS檢測到的標記前后的M(GPx1 monomer)和標記后產(chǎn)物M(M-(HgCH3)3),分子量分別為22651.5 和23326.9 Da,質(zhì)量差為675.4 Da,說明GPx1 monomer中的-SeH基團和2個-SH基團都被成功標記。MALDI-TOF-MS對相同標記產(chǎn)物的分析結(jié)果表明,除GPx1monomer可以被CH3Hg-THI成功標記外,其二聚體、三聚體和四聚體都可以被成功標記,再次證明CH3Hg-THI動態(tài)標記有利于保持GPx1分子的穩(wěn)定性。進一步利用SEC/ICP-MS對標記反應(yīng)進行了定量分析?;贗CP-MS對202Hg 的檢出限(45 pmol/L),GPx1的檢出限可以達到10 fmol,較通過對82Se的檢測靈敏度(100 fmol)提高1個數(shù)量級,說明外源的Hg標簽除了能夠幫助區(qū)分硒蛋白/多肽和含硒蛋白/多肽分子,也能夠有效提高硒蛋白/多肽的檢測能力,有利于低豐度生物分子的研究。

    圖3 (a)CH3Hg+和CH3Hg-THI標記GPx1;(b)SEC-ICP-MS,(c)ESI-IT-MS和(d)MALDI-TOF-MS分析GPx1和其標記產(chǎn)物

    Fig.3 (a) Labeling of glucathione peroxidase 1 (GPx1) directly with CH3Hg+ and CH3Hg-THI under the same experimental conditions; (b) Typical chromatograms of SEC-ICP-MS of native and labeled GPx1; Analysis of the native and CH3Hg-tagged GPx1 by (c) ESI-IT-MS and (d) MALDI-TOF-MS

    3.4 富硒酵母提取物中硒蛋白/多肽的識別和檢測

    富硒酵母中不但含有硒蛋白/多肽,而且有含硒蛋白/多肽和含硒無機小分子,在平衡生物體內(nèi)的Se含量和硒蛋白/多肽功能方面發(fā)揮著重要作用[28~33]。采用PBS緩沖液超聲提取富硒酵母的水溶性組分,對其中硒蛋白/多肽進行識別和檢測。需要注意的是,在CH3Hg-THI標記和SEC/ICP-MS和RPLC/ICP-MS檢測之前,并未對富硒酵母的水溶性提取液進行還原,避免因還原反應(yīng)造成二硫鍵斷裂,產(chǎn)生大量SH基團。CH3Hg-THI對富硒酵母水溶性提取液進行標記后,采用兩種色譜模式SEC (圖4a)和RPLC(圖4b)與ICP-MS聯(lián)用進行分析。SEC/ICP-MS結(jié)果表明,在富硒酵母的水溶性提取物主要含有5個含硒餾分(9.6, 12.8, 21.2, 24.6和31.4 min)。因可同時檢測到Se和Hg的信號(圖4a),9.6,12.8和21.2 min這3個餾分中含有硒蛋白/多肽;與分子量標準物的保留時間相比較,9.6 min組分是分子量大于44.3 kDa的硒蛋白,含量占總Se含量的2.6%;12.8 min保留時間與標準GPx1的保留時間一致,富硒酵母水溶性提取樣品中含有GPx1,占總Se的1.1%;21.2 min餾分的分子量介于1.4~14 kDa,是硒多肽,占總Se的58.8 %;而24.6和31.4 min組分的分子量小于1.4 kDa,又因只觀察到Se的信號,它們可能是含硒的小分子化合物,占Se總含量的33.4 %。相比于SEC,RPLC有更高的分辨率。在相同的分離時間(40 min)內(nèi),RPLC/ICP-MS共檢測到15個色譜峰有Se的信號,其中7個色譜峰

    圖4 富硒酵母水溶性提取液的SEC/ICP-MS(a)和RPLC/ICP-MS(b)分析。*標記的色譜峰為潛在的硒蛋白/多肽。(a)中1, 2, 3, 4和5分別表示分子量標志物(237.0, 66.5, 44.3, 14.3 and 1.4 kDa)的保留時間

    Fig.4 Typical chromatograms of water-soluble extract of Se-enriched yeast analyzed using (a) SEC-ICP-MS and (b) RP-ICP-MS. The marked (*) peaks indicated possible selenoproteins (peptides) in the extract. 1, 2, 3, 4 and 5 in (a) represent the elution time of the five molecular weight markers used (237.0, 66.5, 44.3, 14.3 and 1.4 kDa)

    (*)同時檢測到Se和Hg的信號(圖4b),可認為是硒蛋白/多肽,GPx1位于26.5~30.0 min之間。由圖4b可見,當(dāng)檢測32S16O+時,高含量組分在10 min前被檢測到,這些都是富硒酵母水溶性提取液中高含量的含Cys的蛋白分子(因硒蛋白分子中也可能含有Cys);在這樣的高的背景下,本方法仍可以識別硒蛋白/多肽、含硒蛋白/多肽和其他高豐度蛋白/多肽分子,證明了Se-Hg雙元素標簽標記方法在解決識別和檢測硒蛋白/多肽問題上的優(yōu)越性。值得指出的是,更高分辨能力的多維分離技術(shù)和更高分辨率的質(zhì)譜技術(shù)(如FT-ICR-MS)的聯(lián)合應(yīng)用將有助于已識別的硒蛋白/多肽的組成和結(jié)構(gòu)的進一步鑒定。

    4 結(jié) 論

    提出并發(fā)展了內(nèi)源和外源雙元素標簽標記策略,此策略使得ICP-MS在識別和檢測硒蛋白/多肽方面展示了前所未有的優(yōu)越性。隨著針對不同重要蛋白/多肽分子的雙元素標簽標記策略研究的深入開展,此策略將在識別和定量已知和未知蛋白/多肽分子方面發(fā)揮重要作用。

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