反相高效液相色譜法測定厚樸樹葉中的厚樸酚

摘要： 超聲輔助法提取秦巴山區(qū)野生厚樸樹葉中的厚樸酚，用顯色法和薄層色譜法對厚樸酚進(jìn)行定性鑒定，反相高效液相色譜法測定厚樸樹葉中厚樸酚的含量。采用高效液相色譜儀測定，以 C18為固定相，選擇不同的流動相，檢測波長為294 nm，流速為1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。試驗(yàn)結(jié)果表明，厚樸樹葉中含有厚樸酚，且厚樸酚的含量為075%，以體積比78 ∶ 22的甲醇 ∶ 水為流動相，測得厚樸酚的保留時(shí)間為4 528 min，分離效果好、簡單、靈敏、重現(xiàn)性好、結(jié)果滿意，適合于厚樸樹葉中厚樸酚含量的測定。

關(guān)鍵詞： 厚樸樹葉；厚樸酚；含量；高效液相色譜法；測定

中圖分類號： O657 7+2；R284 2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0311-03

厚樸（Magnolia officinalia）是木蘭科木蘭屬的一種高大落葉植物 [1]，別名川樸、紫油厚樸，樹高15～20 m，廣泛地分布于湖北西部、四川西南部、陜西南部、甘肅南部、江西、安徽、浙江、福建、湖南等地 [2]，厚樸樹皮是我國傳統(tǒng)中藥材，稱為中藥厚樸，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，其后歷代本草均有記載，厚樸的樹皮、根皮、花、籽及嫩芽均能入藥 [3]，有燥濕消痰、化濕導(dǎo)滯、消除腹脹便秘、治療痰飲喘咳、驅(qū)風(fēng)鎮(zhèn)痛等功效，還具有抗菌、抗病毒、抗過敏、影響胃腸活動、松弛肌肉和中樞抑制等作用，以厚樸樹皮為主，將其作為中藥材或深加工的原料使用。厚樸酚是厚樸中的活性物質(zhì)之一 [4]，有抗菌、鎮(zhèn)靜中樞神經(jīng)、松弛肌肉、抗?jié)儭⒖寡趸?、預(yù)防齲齒等藥理作用 [5]，最近研究表明厚樸酚還有抑制癌細(xì)胞的作用 [6]，厚樸酚應(yīng)用廣泛，是一些中成藥如保和丸、藿香正氣水等的主要成分。目前，厚樸酚主要是從厚樸樹皮提取，厚樸樹皮資源有限，厚樸樹一般要生長15年才能符合藥用需要，挖根剝皮，一次性使用，而厚樸樹葉資源卻非常豐富 [7]。人們對厚樸樹葉的開發(fā)利用研究報(bào)道較多 [8]，不同產(chǎn)地和不同季節(jié)厚樸葉中厚樸酚以及和厚樸酚含量存在差異 [9-11]，用高效液相色譜法檢測厚樸樹葉中厚樸酚的含量，不同提取方法測得厚樸樹葉中厚樸酚含量不同 [12-13]，厚樸樹葉提取物對植物病原真菌有抑菌活性 [14]，厚樸樹葉中含有和厚樸樹皮中相同的成分，可用厚樸樹葉提取厚樸酚，厚樸樹葉的利用前景廣闊。陜西南部秦巴山區(qū)有豐富的厚樸資源，本研究采用超聲輔助提取法和索氏回流提取法從厚樸樹葉中提取厚樸酚，進(jìn)行定性鑒定，用反相高效液相色譜法測定厚樸樹葉中厚樸酚的含量 [15]，可為開發(fā)利用厚樸樹葉資源提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1 1 材料、試劑和儀器

1 1 1 試驗(yàn)材料 厚樸樹葉于2012年11月上旬收集于陜西南部秦巴山區(qū)，經(jīng)陜西理工學(xué)院植物學(xué)專家趙樺教授分析和辨認(rèn)，為木蘭科木蘭屬植物厚樸的葉子。置于烘箱50 ℃烘干至恒質(zhì)量，用中草藥粉碎機(jī)粉碎過60目篩，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1 1 2 試劑 厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢驗(yàn)所），色譜甲醇（色譜純，進(jìn)口分裝），乙腈（色譜純TEDIA，進(jìn)口分裝）。乙醇、甲醇、三氯化鐵、間苯三酚、苯、香草醛、硫酸、鹽酸、羧甲基纖維素鈉均為國產(chǎn)分析純，由天津市天力化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)。薄層層析硅膠GF254（分析純，青島海洋化工廠）。 1%香草醛硫酸顯色劑配制：100 mL無水乙醇、1 g香草醛和10 mL濃硫酸，混合均勻。5%的三氯化鐵甲醇水溶液配制：甲醇和水體積比1 ∶ 1混合，按質(zhì)量百分?jǐn)?shù)稱取三氯化鐵，混合均勻。間苯三酚鹽酸溶液：稱取間苯三酚0 1 g，加無水乙醇1 mL，再加鹽酸9 mL，混勻，用時(shí)新配。水為二次蒸餾水。

1 1 3 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），SL二極管陣列檢測器（美國安捷倫公司），Kromasil C18色譜柱（15 cm × 0 46 cm，5 μm，重慶中譜科技有限公司）。超聲清洗機(jī)（浙江省寧波新芝生物股份有限公司），中草藥粉碎機(jī)（F117型，天津市泰斯特儀器有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），循環(huán)式真空泵（SHZ-Ⅲ型，河南省鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），電子分析天平（GR-200，日本），薄層色譜掃描儀（北京化學(xué)科技有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（河南鞏義儀器廠），Soxhelt提取器。

1 2 試驗(yàn)方法

1 2 1 從厚樸樹葉中提取厚樸酚 （1）超聲輔助提取法：準(zhǔn)確稱取0 200 0 g粉碎好的厚樸樹葉粉末置于帶塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，超聲30 min，浸漬24 h。提取液呈深棕色渾濁液體，用真空泵減壓抽濾，濾液呈透亮棕色，用活性炭脫色，減壓回收甲醇，真空干燥提取物。用色譜甲醇溶解，定容到25 mL的容量瓶中，供定性鑒定和含量測試。精確吸取定容液 2 5 mL 于10 mL容量瓶中，加色譜甲醇稀釋到刻度，搖勻，為超聲提取待測樣品溶液。（2）索氏回流提取法：準(zhǔn)確稱取厚樸樹葉細(xì)粉2 000 0 g，用濾紙包好放置于Soxhelt提取器的提取管中，加入250 mL甲醇回流提取48 h，至回流液澄清。提取液呈棕黑色，用活性炭脫色，減壓回收甲醇，真空干燥提取物。用色譜甲醇溶解，定容到250 mL的容量瓶中，供定性鑒定和含量測試。精確吸取定容液2 5 mL于10 mL容量瓶中，加色譜甲醇稀釋到刻度，搖勻，為索氏提取待測樣品溶液。

1 2 2 厚樸酚定性鑒定 （1）厚樸酚定性檢測：分別取超聲提取物和索氏提取物脫色之后的定容液體2 mL各2份于小試管中，再分別加入三氯化鐵甲醇水溶液3滴和間苯三酚鹽酸溶液3滴，搖勻，進(jìn)行顯色反應(yīng)。（2）厚樸酚的薄層色譜法檢測：取超聲提取物和索氏提取物脫色之后的定容液體，另取厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，按照《中國藥典》2010年版一部附錄中薄層色譜法，用毛細(xì)管吸取3種溶液，分別點(diǎn)于同一個(gè)硅膠薄層板上，以苯 ∶ 甲醇=27 ∶ 1為展開劑，展距8 cm，取出，晾干，噴1%香草醛硫酸溶液后，在100 ℃下烘烤2～3 min，取出冷卻，在日光下和薄層色譜掃描儀下分別觀察。

1 2 3 厚樸樹葉中厚樸酚含量的測定 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：準(zhǔn)確稱取厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品1 500 mg，以色譜甲醇為溶劑，定容于10 mL棕色容量瓶中，配制成含厚樸酚0 150 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。用厚樸酚標(biāo)準(zhǔn)品儲備液精確配5個(gè)濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品待測溶液，厚樸酚含量分別是0 012 5、0 025 0、0 037 5、0 050 0、0 062 5 mg/mL，在色譜條件下進(jìn)樣檢測，確定線性標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。色譜條件：用Kromasil C18色譜柱，分別以乙腈 ∶ 水體積比65 ∶ 35和甲醇 ∶ 水體積比78 ∶ 22為流動相進(jìn)行分析測試，流速為1 mL/min，檢測波長294 nm，進(jìn)樣量20 μL，保留時(shí)間8 min，柱溫30 ℃。將超聲提取待測樣品溶液和索氏提取待測樣品溶液與測試標(biāo)準(zhǔn)品待測溶液在同樣色譜條件下測試。

2 結(jié)果與分析

2 1 提取方法選擇

用超聲輔助提取法和索氏回流提取法從厚樸樹葉中提取厚樸酚，索氏回流提取法需要48 h才能提取完全，提取時(shí)間長，且長時(shí)間加熱回流容易引起有效成分的氧化變質(zhì)，使得提取液呈棕黑色，對實(shí)際操作中的提純和含量測定都會帶來很大的影響。超聲輔助提取法溫度低，一般控制在 50 ℃ 以下，所需時(shí)間短，約30 min，操作簡單，由于提取溫度低，有效成分不易損失，能耗低，一般可選用超聲輔助提取法。

2 2 厚樸酚的定性分析

超聲提取物和索氏提取物分別加三氯化鐵甲醇水溶液，均呈現(xiàn)藍(lán)黑色，是厚樸酚的酚羥基反應(yīng)，發(fā)生了顯色反應(yīng)；超聲提取物和索氏提取物分別加間苯三酚鹽酸溶液，出現(xiàn)紅色沉淀，是厚樸酚的丙烯基反應(yīng)，說明有厚樸酚被提取出來。厚樸酚的薄層色譜板在日光下和薄層色譜掃描儀下，超聲提取物和索氏提取物的色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)的位置上，均顯棕紅色斑點(diǎn)，如圖1所示的薄層板分析圖譜，說明厚樸樹葉提取液中含有厚樸酚，還有其他有機(jī)物被提取出來。

2 3 工作曲線的制作

檢測濃度梯度的不同標(biāo)準(zhǔn)品待測溶液，以含量（mg/mL）為縱坐標(biāo)、色譜峰面積為橫坐標(biāo)來繪制工作曲線圖（圖2）。當(dāng)厚樸酚濃度為 0 012 5 mg/mL時(shí)，峰面積為421 489 90；濃度為0 025 0 mg/mL時(shí)，峰面積為822 312 62；濃度為 0 037 5 mg/mL 時(shí)，峰面積為1 264 469 70；濃度為 0 050 0 mg/mL 時(shí)，峰面積為1 665 953 74；濃度為 0 062 5 mg/mL 時(shí)，峰面積為2 055 781 55。由此可見，峰面積與厚樸酚含量建立了良好的線性關(guān)系。厚樸酚含量（y）與峰面積（x）的回歸方程為：y=3 006×10 -5x+1 449 1×10 -5（r=0 999 9），線性范圍在0 012 5 ～0 062 50 mg/mL。

2 4 厚樸樹葉中厚樸酚的含量

在高效液相色譜（HPLC）測定過程中，流動相分別用乙腈 ∶ 水體積比65 ∶ 35和甲醇 ∶ 水體積比78 ∶ 22進(jìn)行比較，測[CM（25]定結(jié)果如圖3所示是以乙腈 ∶ 水體積比為65 ∶ 35作流動

相得到的圖譜，圖4是以甲醇 ∶ 水體積比為78 ∶ 22作為流動相得到的圖譜。從圖3中可以看到，以乙腈和水為流動相時(shí)出峰時(shí)間較早，厚樸酚的保留時(shí)間為3 935 min，各組分不能有效分離，分離度差，干擾嚴(yán)重，峰形不規(guī)則。從圖4中可以看到以甲醇和水為流動相時(shí)出峰時(shí)間合理，厚樸酚的保留時(shí)間為4 528 min，各組分分離度好，干擾小，峰形規(guī)則，含量檢測時(shí)誤差會減小，在測定厚樸樹葉中厚樸酚的含量時(shí)使用甲醇和水（體積比78 ∶ 22）為流動相較好。利用HPLC測定超聲提取待測樣品溶液和索氏提取待測樣品溶液，歸一化法得到峰面積，經(jīng)過轉(zhuǎn)化，表明超聲提取法進(jìn)行提取厚樸樹葉中厚樸酚的含量為0 768%，索氏提取法進(jìn)行提取厚樸樹葉中厚樸酚的含量為0 725%，可見，不同的提取方法測得厚樸樹葉中厚樸酚的含量是存在差異的。和按照《中國藥典》2010年版中的方法測定厚樸樹葉中厚樸酚的最高含量為0 32%相比較，高出了1 4倍，超聲輔助提取法和索氏回流提取法能顯著提高厚樸酚的得率，超聲提取法相對更好一些。

3 結(jié)論

用超聲輔助提取法和索氏回流提取法提取秦巴山區(qū)野生厚樸樹葉中的厚樸酚，能顯著提高得率，比按照《中國藥典》2010年版中的方法提取和檢測厚樸酚的含量高出1 4倍，超聲輔助提取法和索氏回流提取法均能提高厚樸酚的得率，前者比后者會更適合工業(yè)化生產(chǎn)，超聲法提取天然產(chǎn)物中的有效成分已得到廣泛應(yīng)用，可加快浸取速度，提取率高，操作簡單方便。用顯色法和薄層色譜法對提取的厚樸酚進(jìn)行定性鑒定，厚樸樹葉中含有厚樸酚，可從厚樸樹葉中提取厚樸酚。反相高效液相色譜法測定厚樸樹葉中厚樸酚的含量，以 Kromasil C18色譜柱（15 cm × 0 46 cm，5 μm）為固定相，以甲醇和水體積比78 ∶ 22為流動相，檢測波長294 nm，流速為 1 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，測得厚樸酚的保留時(shí)間為 4 528 min，厚樸樹葉中厚樸酚的含量為0 768%，分離效果好，干擾小，峰形規(guī)則，含量檢測時(shí)誤差小，結(jié)果滿意，適合于厚樸樹葉中厚樸酚含量的測定。本試驗(yàn)僅是對厚樸樹葉中的厚樸酚進(jìn)行定性和定量檢測，厚樸樹葉中的其他酚性物質(zhì)檢測和分析還需要進(jìn)一步深入研究。

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