豐花月季低成本組織培養(yǎng)快繁的研究

楊濤+　錢蕾　呂永桂等

摘要： 為降低豐花月季組織培養(yǎng)的生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，從配制培養(yǎng)基的原料、初代培養(yǎng)器皿的類型進(jìn)行了選擇性試驗。試驗結(jié)果，用塑料試管（透氣）來代替玻璃三角瓶（50 mL）、沉淀白開水代替蒸餾水、20 g/L白砂糖代替 30 g/L 蔗糖、省略熬制環(huán)節(jié)直接添加卡拉膠配制的培養(yǎng)基，對豐花月季進(jìn)行組織培養(yǎng)無顯著的影響，幼苗生長健康狀況相似。結(jié)果表明，在規(guī)?；瘮U(kuò)繁豐花月季組培苗時，用試管進(jìn)行初代培養(yǎng)，初代和繼代培養(yǎng)基原料中大量使用的水、糖可以使用沉淀白開水和普通白砂糖替代蒸餾水和高純度蔗糖，同時將熬制和高壓滅菌環(huán)節(jié)合并，培養(yǎng)效果相近，但生產(chǎn)成本顯著降低。

關(guān)鍵詞： 豐花月季；組織培養(yǎng)；快繁；低成本

中圖分類號： S685.120.4+3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）08-0053-03

寒地豐花月季是近幾年培育出的豐花月季新品種系列。具有能夠在黑龍江地區(qū)露地越冬、花期長、耐粗放管理特點，亟需大量的苗木以進(jìn)入推廣應(yīng)用環(huán)節(jié)。但是，通過一般的扦插繁殖，不僅繁殖速度慢、效率低、種苗易退化，而且成苗率受季節(jié)、插穗質(zhì)量、插穗位置、基質(zhì)、溫度等諸多因素的影響，難以在相對較短的時間內(nèi)獲得大量種苗。因此，采用組織培養(yǎng)的方式進(jìn)行快速繁殖是推動寒地豐花月季盡快推廣應(yīng)用的首選繁殖方法。然而，現(xiàn)有較成熟的豐花月季組織培養(yǎng)方案存在成本過高的問題，只有降低擴(kuò)繁過程中的各項成本投入，才能在實際應(yīng)用中產(chǎn)生更大經(jīng)濟(jì)效益、社會效益和生態(tài)效益。

本著節(jié)約成本、減少投入，同時提高生產(chǎn)效率，為豐花月季提供規(guī)模化生產(chǎn)模式的目的，本研究以寒地豐花月季“粉-A”為試驗材料，通過對初代培養(yǎng)使用的器皿類型以及繼代增殖階段對培養(yǎng)基配制環(huán)節(jié)和配制原料的使用進(jìn)行選擇性的試驗，尋找適宜豐花月季低成本組織培養(yǎng)快繁的生產(chǎn)模式，為豐花月季規(guī)?；?、工廠化組織培養(yǎng)生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為豐花月季“粉-A”，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園林植物應(yīng)用課題組提供。

1.2 培養(yǎng)條件

試驗應(yīng)用的常規(guī)培養(yǎng)基中水質(zhì)為蒸餾水，碳源為30 g/L的蔗糖，卡拉膠濃度為6.5 g/L，初代和繼代的培養(yǎng)基配方均為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L，pH值5.8～6.0，培養(yǎng)條件溫度（25±2） ℃，光照時長10～12 h/d，光照度 1 500～2 000 lx。

1.3 試驗方法

1.3.1 培養(yǎng)容器對豐花月季組織培養(yǎng)降低成本的效應(yīng) 設(shè)計初代培養(yǎng)容器單因素試驗，2個因素分別為：（1）帶蓋透氣塑料試管（直徑5 mL，長15 mL）；（2）玻璃三角瓶（50 mL）。每個處理接種30瓶，每瓶接種1個外植體，重復(fù)3次。統(tǒng)計單位面積容器的擺放數(shù)量，20 d后統(tǒng)計其初代培養(yǎng)的污染率、芽苗生長情況，30 d后統(tǒng)計培養(yǎng)基失水、開裂的有效時間。培養(yǎng)基為常規(guī)培養(yǎng)基。

1.3.2 水質(zhì)對豐花月季組織培養(yǎng)的影響 設(shè)計水質(zhì)單因素試驗，4個因素分別為：（1）蒸餾水；（2）自來水；（3）白開水；（4）沉淀白開水（自來水煮沸，靜置2～3 h后，取上層液）。每個處理接種30瓶，每瓶接種1個外植體，重復(fù)3次。檢測不同水質(zhì)的pH值、電導(dǎo)率，觀察培養(yǎng)基外觀，60 d后統(tǒng)計其繼代的生長情況。培養(yǎng)容器為50 mL玻璃三角瓶，培養(yǎng)基中除水質(zhì)外，其他為常規(guī)培養(yǎng)基配方。

1.3.3 碳源對豐花月季組織培養(yǎng)的影響 碳源的單因素試驗中2個因素分別為：（1）蔗糖；（2）白砂糖。蔗糖濃度為 30 g/L，白砂糖濃度3個水平分別為30、20、10 g/L。其他培養(yǎng)條件相同，30 d統(tǒng)計其污染率，60 d統(tǒng)計其繼代的生長情況。培養(yǎng)容器為50 mL玻璃三角瓶，培養(yǎng)基中水質(zhì)為沉淀白開水。

1.3.4 溶膠方式對豐花月季組織培養(yǎng)的影響 （1）傳統(tǒng)培養(yǎng)基：在培養(yǎng)液中添加卡拉膠后進(jìn)行加熱熬制，至卡拉膠全部溶解后，對每一個培養(yǎng)容器進(jìn)行定量分裝，高壓滅菌后，取出自然冷卻。（2）不熬制培養(yǎng)基：先將定量的卡拉膠6.5 g/L均勻地添加進(jìn)去，再將培養(yǎng)液均勻倒入每個培養(yǎng)容器中，按量定容，進(jìn)行高壓滅菌后，取出自然冷卻。

初代培養(yǎng)每個塑料試管培養(yǎng)基定量為5 mL，卡拉膠含量為0.033 g，50 mL玻璃三角瓶培養(yǎng)基定量為20 mL，卡拉膠含量為0.13 g。繼代培養(yǎng)中每個100 mL玻璃方瓶培養(yǎng)基定量為40 mL，卡拉膠含量為0.26 g。其他培養(yǎng)條件相同，觀察培養(yǎng)基的外觀、平均凝固時間和軟硬程度，60 d統(tǒng)計繼代的生長情況。培養(yǎng)基中水質(zhì)為沉淀白開水，碳源為 20 g/L 白砂糖。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)容器對豐花月季組織培養(yǎng)降低成本的效應(yīng)

傳統(tǒng)植物組織培養(yǎng)中，多以玻璃三角瓶為培養(yǎng)容器，最大優(yōu)點是透光性好，一般使用于科學(xué)研究。但是，三角瓶占用空間大，并需要較多的培養(yǎng)基，在大批量生產(chǎn)中會相應(yīng)增加生產(chǎn)成本。

本試驗以50 mL玻璃三角瓶為對照，用塑料試管對豐花月季進(jìn)行初代培養(yǎng)試驗，培養(yǎng)容器對豐花月季組織培養(yǎng)，可有效降低生產(chǎn)成本（表1）。

表1 不同培養(yǎng)容器對豐花月季組織培養(yǎng)的效果

[HJ*5][BG（！][BHDFG4*2，WK5，WK4。6W]容器 擺放數(shù)量（個/m2） 每容器培養(yǎng)基體積（mL） 污染率（%） 培養(yǎng)基有效時間（d） 原料價格（元/個） 生長情況

[BHDG1*2]玻璃瓶 289 20 10.6 25～30 3.5 芽苗健壯

塑料試管 1 000 5 3.4 35～40 0.8 芽苗健壯

從表1可以看出，用試管代替三角瓶作為初代培養(yǎng)容器對豐花月季初代芽的生長狀況無顯著影響；但由于試管的占用空間小，在同樣單位面積的組培架上的擺放量是三角瓶的3.46倍，1 m2可多擺放711棵苗；試管盛裝的培養(yǎng)基僅為三角瓶的25%；初代組培苗的污染率試管容器比三角瓶降低了68%，可能與口徑及培養(yǎng)基表面積較小有關(guān)；同時，由于試管盛裝的培養(yǎng)基深度較大，在相同時間內(nèi)配制的培養(yǎng)基的有效時間，試管要比三角瓶長10 d左右；另外，用試管代替三角瓶作為初代培養(yǎng)容器，容器價格由原來的3.50元降至080元，每個試管成本為三角瓶的22.86%。

帶蓋試管在豐花月季組培生產(chǎn)的初代培養(yǎng)中進(jìn)行應(yīng)用，不僅可以提高單位面積的擺放數(shù)量，減少培養(yǎng)基用量，降低污染率，降低容器成本，由于用帶蓋塑料試管接種初代月季外植體時，省去了用三角瓶接種時拆掉和固定封口膜的時間，可以在單位時間內(nèi)接種更多的外植體。在豐花月季規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)中可極大地提高工作效率，節(jié)省空間，降低成本。

2.2 水質(zhì)對豐花月季組織培養(yǎng)的影響

在組織培養(yǎng)中，蒸餾水制備是費(fèi)時、費(fèi)工、費(fèi)電的過程，在試驗階段用量較少時購買蒸餾水比較合算，但是在規(guī)?；a(chǎn)中購買或制備蒸餾水配制培養(yǎng)基成本都會極大提高，如果自來水經(jīng)過簡單處理能夠作為基質(zhì)水源使用，無疑是最經(jīng)濟(jì)合理的。

本試驗以蒸餾水為對照，分別用自來水、白開水、沉淀白開水配制培養(yǎng)基進(jìn)行豐花月季的組培試驗，不同水質(zhì)對豐花月季生長的影響見表2。

從表2可以看出，不同水質(zhì)的pH值從低到高依次為蒸餾水、自來水、白開水、沉淀白開水；水質(zhì)pH值的大小對組培苗生長無影響，用蒸餾水和自來水配制培養(yǎng)基時，需加堿能達(dá)到規(guī)定pH值；用白開水和沉淀白開水配制培養(yǎng)基時，需加酸能達(dá)到規(guī)定pH值。電導(dǎo)率測量主要用來檢測水的純凈度，是檢測水中離子雜質(zhì)的一種有效、簡便和可靠的方法 [1]。從不同水質(zhì)的電導(dǎo)率可以看出，自來水中的離子雜質(zhì)最多，蒸餾水離子雜質(zhì)含量極少；使用蒸餾水和沉淀白開水配制的培養(yǎng)基均為透明、無色且無雜質(zhì)沉淀，二者對組培苗的生長、葉色和長勢也都有利，植株生長較好。自來水在不添加任何藥劑的情況下進(jìn)行高壓滅菌，會在瓶壁上產(chǎn)生大量白色水垢，影響瓶壁的透光性，因此將自來水煮沸，使雜質(zhì)沉淀，取上層液用于配制培養(yǎng)基效果較好。

2.3 碳源對豐花月季組織培養(yǎng)的影響

碳源在組織培養(yǎng)試驗中消耗量較大，傳統(tǒng)培養(yǎng)基需要蔗糖30 g/L，是培養(yǎng)基中支出較大的部分。本試驗以30 g/L蔗糖為對照，分別用30、20、10 g/L白砂糖配制培養(yǎng)基進(jìn)行豐花月季的組培試驗，不同碳源對豐花月季生長的影響見表3。

蔗糖和白砂糖的成分幾乎相近，是葡萄糖和果糖脫水化合而成的還原性二糖。培養(yǎng)基中的糖，無論是蔗糖還是白砂糖都是先轉(zhuǎn)化為葡萄糖再為月季的分化所吸收利用 [2]。白砂糖的市場價為蔗糖的1/10，大大節(jié)約了月季組織培養(yǎng)的生產(chǎn)成本。糖是各種微生物生殖繁衍的碳源，一旦被微生物侵染，很快在培養(yǎng)基上繁殖造成污染，使組織培養(yǎng)的成本上升，不利于規(guī)?；a(chǎn) [3]。從表3可以看出，當(dāng)碳源為10 g/L白砂糖時，污染率最低，但是組培苗葉片顏色偏黃，苗細(xì)弱，長勢較弱；碳源為30 g/L蔗糖、30 g/L白砂糖時，組培苗的葉片均為深綠色，苗生長健壯，長勢旺盛，污染率較高，蔗糖成本高；碳源為20 g/L白砂糖時，植株生長健壯，葉片綠色，長勢旺盛，污染率偏低，成本較低。

研究結(jié)果表明，組織培養(yǎng)苗長期依賴外源糖，葉片表皮結(jié)構(gòu)發(fā)育不良，葉片小，葉綠素含量降低，喪失光合作用能力或光合作用受到抑制，影響組織培養(yǎng)苗的質(zhì)量 [4]。適當(dāng)降低糖（碳源）濃度，有利于提高組培苗的質(zhì)量、降低污染率。綜合考慮上述因素，在豐花月季規(guī)?；⒐S化組織培養(yǎng)中，在對組培苗影響不大的情況下應(yīng)盡量用較低的糖濃度。

2.4 溶膠方式對豐花月季組織培養(yǎng)的影響

傳統(tǒng)配制培養(yǎng)基時，在添加卡拉膠后需要進(jìn)行加熱熬制，目的是為了將卡拉膠完全溶解于培養(yǎng)液中，有利于培養(yǎng)基的凝固，但是在大量生產(chǎn)月季組培苗時，熬制培養(yǎng)基是耗費(fèi)時間和能源的過程。

[JP3]本試驗以傳統(tǒng)熬制培養(yǎng)基的方法為對照，與在溶液中添加培養(yǎng)基原料后直接進(jìn)行高壓滅菌，省略了熬制過程的培養(yǎng)基進(jìn)行繼代生長狀況比較，不同溶膠方式對組培苗生長的影響見表4。

從表4結(jié)果可以看出，用2種方式配制培養(yǎng)基，無論是培養(yǎng)基外觀、平均凝固時間、軟硬度還是植株葉色、長勢都較一致，對試驗結(jié)果無不良影響。由此可見，在培養(yǎng)基配制過程中，溶液中添加卡拉膠后直接進(jìn)行高壓滅菌的方式是可行的，可以為豐花月季規(guī)?；⒐S化組織培養(yǎng)生產(chǎn)簡化操作程序，節(jié)省能源，提高培養(yǎng)基配制效率。

3 與結(jié)論與討論

[JP2]在繼代增殖培養(yǎng)中，組培苗需要增殖分化，如果選用塑料試管（透氣）作為培養(yǎng)容器空間太小，會影響組培苗的生長，因此塑料試管（透氣）只適合作為月季組培的初代培養(yǎng)容器。曾有人利用密封的塑料袋來代替玻璃容器進(jìn)行草本植物的繼代培養(yǎng)，而對于月季這樣的木本植物，密封的塑料袋易變形，不利于組培苗營養(yǎng)的吸收?？捎霉u瓶和普通玻璃瓶來代替三角瓶作為繼代培養(yǎng)容器。那寧馨等用果醬瓶等小罐頭瓶替代三角瓶培養(yǎng)蘆薈 [5]，程麗芬用廣口果醬瓶代替三角瓶培養(yǎng)珍稀陰生觀葉花木 [6]，李江等用玻璃瓶代替三角瓶培養(yǎng)櫻桃 [7]，均不會影響組培苗的增殖和生長。因此對于培養(yǎng)容器來說，只要容器空間大小適宜，透光性好是最重要的選擇條件。

從碳源角度降低培養(yǎng)成本，無糖培養(yǎng)無疑是最佳選擇。李宗菊等用無糖培養(yǎng)基，在強(qiáng)光高CO2濃度條件下，小植株增重生長顯著 [8]，表明在外界增施CO2的前提下，一些組織培養(yǎng)苗可以在少糖或無糖的培養(yǎng)基中生長得更好。但是，培養(yǎng)過程中提高培養(yǎng)環(huán)境的CO2濃度需要密閉性極好的空間，這種措施的實際操作性還有待進(jìn)一步完善。

本試驗中在培養(yǎng)基不熬制的情況下，為做到快速準(zhǔn)確，添加卡拉膠需要找出容積正好為5、20、40 mL的容器和盛裝卡拉膠的量為0.033、0.26 g的盛具。本試驗中通過多次試驗，利用不同型號的EP管并進(jìn)行適度人工修整，制作出一套適合的容器和盛具。在規(guī)?；?、工廠化的組培生產(chǎn)中，由于培養(yǎng)液和卡拉膠的量是定量添加到容器中的，根據(jù)需要定制稱量容器和盛具，甚至是機(jī)械化稱量，都具有較高的可行性。

降低組織培養(yǎng)成本的其他措施：龐淑敏等用蛭石代替高成本瓊脂作為馬鈴薯快繁培養(yǎng)基的支持體 [9]；張和琴用蛭石固化物代替瓊脂為月季生根 [10]；鄭加協(xié)等用不加瓊脂的簡化培養(yǎng)基對蜜寶菠蘿的芽繼代增殖和生根進(jìn)行液體淺層培養(yǎng) [11]。張繼東用果醬瓶代替燒杯作接種器械冷卻支架試驗 [12]。培養(yǎng)室溫度、光源和外植體不同部位的選擇也是降低成本的重點考慮因素，降低或控制月季組培過程中的污染率，也是降低生產(chǎn)成本不可忽視的關(guān)鍵問題。

在進(jìn)行植物組織培養(yǎng)規(guī)?；a(chǎn)中，節(jié)約生產(chǎn)成本、提高生產(chǎn)效率的措施落實在各個環(huán)節(jié)，通過系統(tǒng)的規(guī)劃和設(shè)計，以最低的產(chǎn)能高效生產(chǎn)植物組培苗是完全可行的。

[JP2]帶蓋試管代替玻璃三角瓶（50 mL）應(yīng)用在豐花月季組培生產(chǎn)的初代培養(yǎng)中，單位面積的擺放數(shù)量增加為原來的3.46倍，培養(yǎng)基用量減少為原來的25%，并減少了68%的污染率，培養(yǎng)基有效時間延長了10 d左右，容器成本為原來的2286%；用燒開后經(jīng)過沉淀的自來水代替高成本的蒸餾水，價格由原來的200元/t降低為3.1元/t，在忽略污染損失的情況下，水成本降低了98.45%；選擇低成本的20 g/L白砂糖代替高成本的30 g/L蔗糖為碳源，污染率降低了47%，碳源成本為原來的13%；在豐花月季組織培養(yǎng)配制培養(yǎng)基的過程中，去掉加熱熬制培養(yǎng)基的步驟，培養(yǎng)基對月季組培苗生長無影響。采用上述有效措施培養(yǎng)效果相似，成本可大幅度降低。

[HS2*2][HT8.5H]參考文獻(xiàn)：

[1] 張 偉，袁夢琦. 解析超純水領(lǐng)域的電導(dǎo)率測量[J]. 世界儀器與自動化，2007（5）：58-60.

[2]劉 英，陳美霞，郝會軍. 半夏組織培養(yǎng)中降低成本的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（3）：983-984，987.

[3]王秋潔，李 青. 降低植物組織培養(yǎng)成本的研究進(jìn)展[J]. 江蘇林業(yè)科技，2006，33（4）：42-45.

[4]丁永前，丁為民，崔 瑾，等. 組培環(huán)境CO2增施監(jiān)控系統(tǒng)的設(shè)計與試驗[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2002，18（1）：96-98.

[5]那寧馨，郭曉華，齊淑艷，等. 木立蘆薈和三角蘆薈的組織培養(yǎng)和低成本快繁[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，32（2）：107-109.

[6]程麗芬. 簡化培養(yǎng)基試驗[J]. 山西林業(yè)科技，1999（3）：1-4.

[7]李 江，馬正炳，孫仲序，等. 植物組織培養(yǎng)的簡化[J]. 植物生理學(xué)通訊，2003，39（4）：356-358.

[8]李宗菊，周應(yīng)揆，桂明英，等. 滿天星無糖組培快繁技術(shù)研究[J]. 云南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1999，21（2）：134-138.

[9]龐淑敏，方貫?zāi)龋芙ㄈA. 用蛭石做馬鈴薯快繁培養(yǎng)基支持體的初步研究[J]. 中國馬鈴薯，2003，17（5）：292-293.

[10] 張和琴. 不同固化物對月季試管苗生根影響的研究[J]. 園藝學(xué)報，1991，18（2）：180-182.

[11]鄭加協(xié)，李華東，甘勇輝. 蜜寶菠蘿組織培養(yǎng)及低成本快繁技術(shù)研究[J]. 果樹學(xué)報，2005，22（1）：27-30.

[12]張繼東. 降低組織培養(yǎng)成本研究——果醬瓶代替燒杯作接種器械冷卻支架試驗[J]. 農(nóng)業(yè)科技與信息，2009（2）：60-61.