血漿APC和DCC基因啟動(dòng)子甲基化測(cè)定在肺癌早期診斷中的應(yīng)用

朱宇敏，李堅(jiān)，俞立超，朱立歡，陳萍（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院.呼吸科，.胸外科，江蘇鎮(zhèn)江 00）

血漿APC和DCC基因啟動(dòng)子甲基化測(cè)定在肺癌早期診斷中的應(yīng)用

朱宇敏1，李堅(jiān)1，俞立超2，朱立歡1，陳萍1
（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院1.呼吸科，2.胸外科，江蘇鎮(zhèn)江 212001）

目的：檢測(cè)肺癌患者血漿游離 DNA中腺瘤樣結(jié)腸息肉易感基因（adenomatous polyposis coli，APC）和結(jié)直腸癌缺失基因（deleted in colorectal carcinoma，DCC）啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)并分析其在肺癌診斷中的意義。方法：應(yīng)用甲基化特異性 PCR（methylation specific PCR，MSP）法，檢測(cè)70例肺癌患者、40例肺良性病變患者和30例健康志愿者血漿APC和DCC兩個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)。同時(shí)測(cè)定血清癌胚抗原，并與血漿 APC和DCC基因甲基化測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果：（1）肺癌患者血漿標(biāo)本中 APC、DCC基因啟動(dòng)子甲基化陽性檢出率分別為25.71％（18/70）、35.71％ （25/70），接近于血清癌胚抗原的陽性率（37.14％）；肺良性病變患者血漿中 APC、DCC基因啟動(dòng)子甲基化陽性率分別為2.50％（1/40）、7.50％（3/40）；健康志愿者血漿中這兩個(gè)基因未檢測(cè)出甲基化；3組間兩基因甲基化陽性率間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；（2）APC和 DCC兩個(gè)基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)診斷肺癌的靈敏度為51.43％，特異度為90.00％；血漿APC、DCC基因甲基化和血清癌胚抗原三項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高肺癌診斷的靈敏度（68.57％），但特異度輕微下降（82.50％）；（3）APC和DCC基因啟動(dòng)子甲基化與肺癌患者年齡、性別、吸煙指數(shù)、組織學(xué)類型、分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論：外周血漿中 APC、DCC基因甲基化有望成為診斷肺癌的腫瘤標(biāo)志物，在肺癌早期診斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

肺癌；血漿DNA；甲基化特異性 PCR；腺瘤樣結(jié)腸息肉易感基因；結(jié)直腸癌缺失基因

［Abstract］Objective:To evaluate clinical utility of the genes promoter hypermethylation of adenomatous polyposis coli（APC）and deleted in colorectal carcinoma（DCC）in plasma for the early diagnosis of lung cancer.Methods:A methylation specific PCR（MSP）was used to detect the status of APC and DCC promoter hypermethylation in plasma DNA from 70 lung cancer patients，40 benign lung disease patients and 30 healthy volunteers.Serum carcinoembryonic antigen（CEA）was detected simultaneously and compared with the plasma APC and DCC genes methylation.Results:（1）The positive rates of plasma APC and DCC genes promoter methylation in lung cancer patients were 25.71％ （18/70）and 35.71％ （25/70），respectively，which were similar to the positive rate of serum CEA（37.14％）.Whereas the positive rates of APC and DCC genes methylation in plasma of benign lung disease patients were 2.50％ （1/40）and 7.50％ （3/40），respectively.The two genes methylation in plasma was not found in healthy volunteers.There was a significant difference between patients with lung cancer and patients with benign lung disease in plasma APC and DCC genes promoter methylation（P＜0.05）；（2）Combination of plasma APC and DCC genes methylation raised sensitivity to 51.43％，with 90.00％specificity for the diagnosis of lung cancer.Com-bined use of APC，DCC and CEA achieved sensitivity of 68.57％，with slight decrease of specificity （82.50％）；（3）APC and DCC genes promoter methylation in lung cancer patients were not associated with the age，sex，smoking index，pathological types，the degree of tumor differentiation，clinical staging and lymph metastasis of patients with lung cancer.Conclusion:Plasma APC and DCC genes methylation might be two potential candidates as tumor markers of lung cancer.The detections of the two genes methylation may be a complementary tool for the early diagnosis of lung cancer.

［Key words］lung cancer；plasma DNA；methylation specific PCR；adenomatous polyposis coli；deleted in colorectal carcinoma

肺癌是全球公認(rèn)的癌癥相關(guān)致死的首要原因，且致死率呈逐年上升趨勢(shì)，即便可手術(shù)治療，其預(yù)后仍不盡人意，難點(diǎn)在于早期診斷［1］。肺癌患者的總體長(zhǎng)期生存率較低，5年生存率低于15％，但Ⅰ期和Ⅱ期患者的 5年生存率分別為 57％～67％和38％～55％［2］，提示早期診斷和治療可明顯提高 5年生存率。眾所周知，血液中檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的分子遺傳標(biāo)志物可以用于癌癥的診斷、治療效果評(píng)估及監(jiān)測(cè)病情進(jìn)展［3］。研究表明，血漿中循環(huán) DNA與腫瘤的發(fā)病機(jī)制有關(guān)聯(lián)［4-9］，可作為腫瘤診斷和預(yù)后評(píng)估的工具。因此，篩選出有價(jià)值的腫瘤標(biāo)志物成為肺癌早期診斷的一個(gè)重要研究方向。近年來，表觀遺傳學(xué)成為分子腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，DNA甲基化是其中頗為重要的一種表現(xiàn)形式，大量研究證實(shí)DNA甲基化在胚胎發(fā)育、基因表達(dá)、細(xì)胞增殖等方面起重要作用，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。抑癌基因甲基化失活是腫瘤發(fā)生的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，而啟動(dòng)子 CpG島甲基化是抑癌基因失活的重要方式。本實(shí)驗(yàn)中，我們采用甲基化特異性 PCR （methylation specific PCR，MSP）檢測(cè)肺癌患者外周血血漿中腺瘤樣結(jié)腸息肉易感基因（adenomatous polyposis coli，APC）和結(jié)直腸癌缺失基因（deleted in colorectal carcinoma，DCC）甲基化狀態(tài)，探討其在肺癌早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2013年 5月至 2014年10月期間在本院就診，經(jīng)病理組織學(xué)確診為肺癌的患者70例為研究對(duì)象，其中男58例，女12例，年齡38～81歲，中位年齡63.96歲。根據(jù) WHO肺癌組織學(xué)分類，鱗癌30例，腺癌 29例，小細(xì)胞肺癌 9例，未分型 2例；中、高分化19例，低分化、未分化 51例。按國際抗癌聯(lián)盟2009年修訂的肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，符合Ⅰ期 +Ⅱ期 24例，Ⅲ期 +Ⅳ期 46例。所有患者均排除其他惡性腫瘤病史。選擇我院呼吸內(nèi)科同期住院治療的40例肺部良性疾病患者作為對(duì)照，其中男29例，女11例，年齡18～85歲，中位年齡59.08歲。該組所有病例均無肺部或其他器官的惡性腫瘤，其中肺炎15例，慢性阻塞性肺病10例，肺結(jié)核 5例，支氣管擴(kuò)張4例，間質(zhì)性肺病、哮喘、肺囊腫、炎性假瘤、支氣管炎及肺門淋巴結(jié)炎性增生各1例。另選擇30例健康志愿者為健康組，其中男13例，女17例，年齡51～67歲，中位年齡60.37歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有受試者均于治療前抽取清晨空腹外周靜脈血 2 mL，EDTA抗凝，2 500 r/min離心10 min分離血漿，再以12 000 r/min離心10 min，獲得無血細(xì)胞成分的血漿，以1.5 mL EP管分裝，于 -80℃保存待檢測(cè)。同時(shí)抽取靜脈血標(biāo)本檢測(cè)血清癌胚抗原，根據(jù)試劑盒說明書標(biāo)示，癌胚抗原的正常上限為5 μg/L。

1.2.2 血漿 DNA提取 采用 QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN公司，德國）提取血漿 DNA。每份標(biāo)本使用1 mL血漿，按照說明成比例地增大所需的反應(yīng)試劑用量，多次過離心柱，最后以 50 μL AE緩沖液洗脫DNA，-20℃保存。

1.2.3 亞硫酸氫鈉修飾 按說明以 EZ DNA Methylation-Gold Kit（Zymo Research，美國）對(duì)所提取的血漿 DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉修飾，將 DNA序列中未甲基化的胞嘧啶（C）轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ぃ║）。最終以20 μL M-洗脫緩沖液洗脫修飾后的 DNA，-20℃保存。

1.2.4 MSP 參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì) APC基因［10］和 DCC基因［11］引物，分別識(shí)別甲基化特異性序列（M）和非甲基化特異性序列（U），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列及MSP反應(yīng)條件見表1。

MSP反應(yīng)體系20 μL，其中 DreamTaq Green PCR Master Mix（2×）10 μL（Thermo Scientific，美國），上下游引物各0.5 μL（10 pmol），修飾后的DNA模板4μL，去離子水 5 μL，充分混勻后置于DNA擴(kuò)增儀中擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3 min，95℃變性30 s、60℃或62℃退火30 s、72℃延伸30 s，共38個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。以人甲基化/非甲基化 DNA標(biāo)準(zhǔn)品（北京天恩澤公司）作為甲基化陽性和陰性對(duì)照，水空白代替 DNA作為空白對(duì)照。

表1 引物序列及其擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳 MSP結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL行2％～2.5％瓊脂糖凝膠電泳（10 V/cm，45 min）鑒定，電泳緩沖液為1×TB緩沖液，500 bp標(biāo)準(zhǔn)參照物作標(biāo)記，溴化乙啶染色后凝膠成像系統(tǒng)拍照。甲基化結(jié)果判定:甲基化引物擴(kuò)增后出現(xiàn)陽性條帶，不論非甲基化引物擴(kuò)增結(jié)果如何均視為基因甲基化；非甲基化引物擴(kuò)增后出現(xiàn)陽性條帶，而不出現(xiàn)甲基化條帶的樣品視為基因未甲基化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù) +假陰性例數(shù)）；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù) +假陽性例數(shù)）；陽性預(yù)測(cè)值 =真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)）；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù)）。計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)或 Fisher精確檢驗(yàn)法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血漿APC和 DCC基因甲基化檢測(cè)結(jié)果

肺癌患者血漿標(biāo)本中 APC、DCC基因啟動(dòng)子甲基化陽性檢出率分別為25.71％（18/70）、35.71％ （25/70）；良性肺病患者血漿標(biāo)本中 APC、DCC基因啟動(dòng)子甲基化陽性率分別為2.50％（1/40）、7.50％ （3/40）；健康志愿者外周血漿中未檢出這兩個(gè)基因啟動(dòng)子甲基化。3組間 APC基因和 DCC基因甲基化檢測(cè)結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 18.015，23.732，P均 ＜0.001）。MSP電泳結(jié)果見圖1。

圖1 肺癌患者血漿中 APC、DCC基因的甲基化狀態(tài)

2.2 兩類基因甲基化測(cè)定對(duì)肺癌的診斷效果

我們將肺癌患者血漿 APC和DCC基因甲基化的測(cè)定結(jié)果與血清癌胚抗原測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。由表2可見，血漿APC和 DCC基因甲基化檢測(cè)診斷肺癌的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值與血清癌胚抗原檢測(cè)結(jié)果相似，雖然靈敏度略低于血清癌胚抗原，但特異度要高于血清癌胚抗原。APC和DCC基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷的靈敏度（51.43％），并有較高的特異度（90.00％）。APC、DCC基因甲基化和血清癌胚抗原 3項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)用于肺癌診斷可進(jìn)一步提高靈敏度（68.57％），但特異度有所下降（82.50％）。

表2 血漿 APC、DCC基因甲基化及血清癌胚抗原檢測(cè)診斷肺癌的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值％（n/n）

2.3 肺癌患者血漿 APC和 DCC基因甲基化狀態(tài)與臨床病理特征間的關(guān)系

兩類基因甲基化測(cè)定結(jié)果與肺癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析顯示，血漿APC和DCC基因啟動(dòng)子甲基化陽性與肺癌患者的性別、年齡、吸煙指數(shù)、組織學(xué)類型、分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均無明顯相關(guān)性（P均＞0.05），見表3。

表3 肺癌患者血漿 APC、DCC基因甲基化狀態(tài)與臨床病理特征間的關(guān)系

3 討論

肺癌發(fā)病率居我國惡性腫瘤首位，大部分肺癌患者確診時(shí)已處于中晚期，失去了最佳治療時(shí)機(jī)，因此，早期診斷是臨床亟須解決的問題之一。早在1977年，Leon等［12］報(bào)道健康者的血清或血漿中僅含有極少量游離的DNA，約（13±3）ng/mL，而腫瘤患者外周循環(huán)血中DNA的含量明顯增加，約（180± 38）ng/mL。近來研究也顯示，在肺癌患者血液DNA中可檢測(cè)到與原發(fā)腫瘤細(xì)胞一致的分子遺傳學(xué)特征［3］。故可通過留取肺癌患者的外周血標(biāo)本，從基因水平檢測(cè)出與肺癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物，以診斷肺癌的存在。APC基因是 Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要的抑癌基因［13］，位于人類染色體5q21，長(zhǎng)度為8 535 bp，含 21個(gè)外顯子。該基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化使之失活，呈不表達(dá)或低表達(dá)，而基因表達(dá)缺失可使 Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路異常而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［14-16］。據(jù)報(bào)道，APC基因啟動(dòng)子高甲基化導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄缺失，可見于結(jié)直腸癌、食管癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤［14］。Laird［17［18］得出的靈敏度（24.36％）和特異度（100.00％）的結(jié)果基本一致。

DCC基因是 Fearon等［19］研究結(jié)直腸腫瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，位于人類染色體18q21.1，長(zhǎng)度為1.4M bp，含 29個(gè)外顯子。Llambi等［20］發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中，啟動(dòng)子甲基化和基因缺失是導(dǎo)致 DCC基因表達(dá)顯著下降的主要機(jī)制。Begum等［2］用熒光定量MSP法檢測(cè)出肺癌患者血漿中 DCC基因的靈敏度為 35.50％，特異度為100.00％；Ostrow等［21］檢測(cè)出27.14％（19/70）肺癌患者血漿中DCC基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生了甲基化。本研究顯示，肺癌患者血漿中DCC基因檢測(cè)的靈敏度為35.71％，特異度為 92.50％，結(jié)果與上述研究基本一致。本研究還表明，血漿APC、DCC基因甲基化與患者性別、年齡、吸煙指數(shù)、組織學(xué)類型、分化程度、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均不相關(guān)。

癌胚抗原是一種廣譜性的腫瘤標(biāo)志物，臨床上已用于包括肺癌在內(nèi)多種腫瘤的診斷，具有一定的診斷價(jià)值，但其特異性不高。研究表明，血清癌胚抗原水平與肺癌的分期相關(guān)，分期越晚，血清癌胚抗原水平越高，故對(duì)肺癌早期診斷的作用并不明顯。本研究發(fā)現(xiàn)，APC和DCC基因啟動(dòng)子甲基化陽性檢測(cè)結(jié)果與肺癌的臨床分期無相關(guān)性，Ⅰ-Ⅱ期患者血漿中這兩個(gè)基因甲基化陽性率與Ⅲ-Ⅳ期肺癌患者間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明 APC、DCC基因啟動(dòng)子甲基化可能是肺癌發(fā)生的早期分子事件，早期肺癌患者仍可在血漿標(biāo)本檢測(cè)到與中晚期肺癌患者相似的陽性率。這一結(jié)果提示檢測(cè)血漿APC和DCC基因甲基化在早期肺癌診斷中的潛在應(yīng)用價(jià)值。在本研究中，兩個(gè)基因甲基化的陽性檢出率與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移亦無相關(guān)性，其在肺癌診斷中的臨床意義與上述相同。

眾多實(shí)驗(yàn)證實(shí)，單個(gè)基因出現(xiàn)甲基化狀態(tài)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中并不起決定性作用，腫瘤的發(fā)生及病情進(jìn)展是多基因、多步驟異常變化的結(jié)果，包括出現(xiàn)多個(gè)基因的甲基化；因此，多個(gè)基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)可能對(duì)腫瘤的診斷更具意義。Esteller等［22］測(cè)定非小細(xì)胞肺癌患者血漿中多個(gè)與腫瘤相關(guān)的 DNA甲基化狀態(tài)，結(jié)果表明多個(gè)基因甲基化聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度為33％～80％。Begum等［2］研究表明，聯(lián)合檢測(cè)肺癌患者血漿中多個(gè)基因可將靈敏度由35.5％提高到75.0％。本實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合檢測(cè)APC、DCC基因甲基化及血清癌胚抗原 3個(gè)腫瘤標(biāo)志物，雖特異度有所下降（82.50％），但靈敏度增高到68.57％，說明多個(gè)指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高診斷的靈敏度，有利于肺癌的早期診斷。

研究表明，巢式PCR或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR更能提 高 基 因 甲 基 化 的 檢 測(cè) 率［23-24］。有 報(bào) 道 指 出TaqMan方法的靈敏度是傳統(tǒng)定量MSP法的10倍，但高靈敏度的方法易降低其特異度［25］。故在甲基化分析的眾多方法中，我們選用了 MSP法，其對(duì)血清、血漿樣本和石蠟包埋組織中微量的DNA模板均可進(jìn)行甲基化檢測(cè)，且不受內(nèi)切酶的限制，簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)使其更易在實(shí)驗(yàn)室中廣泛開展。

綜上，APC和DCC基因的甲基化與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為肺癌診斷的標(biāo)志物。采用MSP法對(duì)APC和DCC基因進(jìn)行甲基化檢測(cè)，結(jié)合其他腫瘤標(biāo)志物測(cè)定，有望成為肺癌早期診斷的重要輔助手段。今后，我們還可將腫瘤患者血漿中抑癌基因甲基化檢測(cè)用于腫瘤的治療效果、預(yù)后、復(fù)發(fā)等多方面的研究。

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Clinical utility of plasma APC and DCC genes promoter hypermethylation in the early diagnosis of lung cancer

ZHU Yu-Min1，LI Jian1，YU Li-Chao2，ZHU Li-Huan1，CHEN Ping1
（1.Department of Respiratory Medicine，2.Department of Thorax Surgery，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

R734.2

A

1671-7783（2015）01-0062-06

10.13312/j.issn.1671-7783.y140290

朱宇敏（1987—），女，碩士研究生；李堅(jiān)（通訊作者），教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，E-mail:lijian541226@163.com

2014-11-10 ［編輯］劉星星