miR-93在急性髓系白血病中的表達(dá)及其與 miR-378表達(dá)的相關(guān)性

湯琴，尹家瑜，朱曉雯，張盈盈，周靜東，鄧兆群（.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科，江蘇 鎮(zhèn)江 22002；2.江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院血液科，江蘇 金壇2200；.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 22002）

miR-93在急性髓系白血病中的表達(dá)及其與 miR-378表達(dá)的相關(guān)性

湯琴1，2，尹家瑜1，朱曉雯1，張盈盈1，周靜東1，鄧兆群3
（1.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院血液科，江蘇 鎮(zhèn)江 212002；2.江蘇大學(xué)附屬金壇醫(yī)院血液科，江蘇 金壇213200；3.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江 212002）

目的：探討微小RNA-93（miR-93）在急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）中的表達(dá)特點(diǎn)及其與miR-378表達(dá)的相關(guān)性。方法：用實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈反應(yīng)（RQ-PCR）檢測84例AML患者及16例健康對照骨髓單個核細(xì)胞中 miR-93成熟體的表達(dá)水平。分析 miR-93高表達(dá)對 AML患者預(yù)后的影響及其與 miR-378表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果：84例 AML患者中有14例過表達(dá) miR-93（16.7％）。miR-93高表達(dá)組患者除白細(xì)胞數(shù)（3.11× 109/L）明顯低于低表達(dá)組（14.55×109/L，P=0.003）外，其他參數(shù)如性別、年齡、血紅蛋白和血小板等均無明顯差異。與其他核型分組［10/38（26.3％）］比較，中等預(yù)后核型分組中 miR-93高表達(dá)的頻率明顯下降［4/46（8.7％），χ2=4.652，P=0.041］。Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，miR-93表達(dá)率與 miR-378表達(dá)率呈正相關(guān)（r=0.321，P＜0.01）。結(jié)論:miR-93在 AML中表達(dá)率明顯增加，且與miR-378表達(dá)率呈正相關(guān)。miR-93聯(lián)合 miR-378的表達(dá)可能作為 AML診斷的參考依據(jù)。

微小 RNA；微小 RNA93；急性髓性白血病

［Abstract］Objective:To investigate the expression of miR-93 in acute myeloid leukemia（AML）patients and the correlation between miR-93 and miR-378.Methods:Real-time quantitative PCR was performed to detect the expression level of miR-93 in AML patients.The clinical significance of miR-93 expression in AML was investigated.Results:miR-93 overexpression was identified in 14（16.7％）of 84 AML patients.The patients with miR-93 overexpression had lower white blood cell level than those without miR-93 overexpression（3.11×109/L versus 14.55×109/L，respectively，P=0.003）.Compared with other karyotype classifications，the frequency of miR-93 overexpression in the intermediate ones was lower［4/46（8.7％）versus 10/38（26.3％），P=0.041］.Spearman correlation analysis revealed positive association between the two miRNAs，with r=0.321 between miR-93 and miR-378.Conclusion: miR-93 might serve as a diagnostic molecule with miR-378 in AML.

［Key words］microRNA；miR-93；acute myeloid leukemia

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，表現(xiàn)為造血祖細(xì)胞的分化和增殖異常，從而導(dǎo)致致命性的感染、出血、器官浸潤等［1］。微小RNA是一類長度約為20～22 nt的真核生物內(nèi)源性小分子非編碼單鏈RNA，參與人體內(nèi)多種重要的生理過程，包括細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等［2］。近年來研究顯示，微小RNA與 AML的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-93能夠促進(jìn)腫瘤的生長、血管的形成以及細(xì)胞的增殖［3-4］。miR-93的表達(dá)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、非小細(xì)胞肺癌以及乳腺癌中均明顯增高，且與胃癌的預(yù)后密切相關(guān)［5-8］。眾多研究表明，miR-93和 miR-378都是促癌基因［3，9］。但是，miR-93在AML中的表達(dá)狀況及其與 miR-378表達(dá)的相關(guān)性尚未見報道。我們檢測了急性髓性白血病患者骨髓單個核細(xì)胞中miR-93的表達(dá)量，并對其與 miR-378表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行了分析。

1 對象與方法

1.1 病例

84例AML患者均為2005年10月至2014年3月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院接受住院治療的初診病例，其中男48例，女36例，年齡10～87歲（中位53歲），診斷按 FAB和WHO 2008版標(biāo)準(zhǔn)（原始細(xì)胞≥20％）［10-11］。核型分析應(yīng)用常規(guī) R顯帶技術(shù)，核型分組按照文獻(xiàn)［12］進(jìn)行。對照組16例為疑似白血病患者，后經(jīng)骨髓穿刺病理學(xué)后而排除，且未患其他疾病。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分離與 RNA制備 全部患者均于初診時抽取骨髓10 mL，肝素抗凝，用 Ficoll密度梯度離心法分離骨髓單個核細(xì)胞，應(yīng)用 mirVana miRNA試劑盒提取總RNA（Ambion公司，美國），經(jīng)紫外分光光度儀檢測 RNA濃度及純度［D（260 nm）/D（280 nm）比值在1.8～2.0間］，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 反轉(zhuǎn)錄

20 μL反應(yīng)體系包括蒸餾水14 μL、緩沖液4 μL、RNA 1 μL、反轉(zhuǎn)錄酶1 μL（Qiagen公司，miScript Reverse Transcription Kit Cat.218061）混勻離心。PCR程序包括兩步:①37℃1 h，②95℃5 min，隨后4℃保持。

1.2.3 RQ-PCR檢測樣品中 miR-93成熟體的表達(dá)

引物設(shè)計采用 Primer Premier 5.0軟件，miR-93特異引物序列為5′-CAAAGTGCTGTTCGTGCAGGT-3′。內(nèi)參為U6管家基因，上游引物為5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下 游 引 物 為 5′-AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG-3′，引物由上海基康生物技術(shù)有限公司合成。20 μL PCR反應(yīng)體系包括賽博綠 PCR混合溶液10 μL，1.0 μmol/L的通用引物2 μL，以及1.0 μmol/L的特異性上游引物。反應(yīng)在ABI 7300擴(kuò)增儀（Applied Biosystems公司，美國）上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性15 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸34 s，共40個循環(huán)，熔解曲線程序?yàn)?5℃15 s，60℃60 s，95℃15 s，60℃15 s。每次擴(kuò)增均以重組 miR-93質(zhì)粒為陽性對照，以雙蒸水作為無模板對照（NTC）。選取 miR-93與U6表達(dá)ΔCT值最小的1例對照標(biāo)本作為參比對照，設(shè)定為1。miR-93基因表達(dá)量的計算采用如下公式:；ΔCT指對照與標(biāo)本之間miR-93與 U6循環(huán)閾值（CT）的差值。熔解曲線揭示PCR產(chǎn)物為單一峰。隨機(jī)選取2例 PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序證實(shí)序列正確。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料間的差異分析采用 Kruskal-Wallis（多組間比較）或 Mann-Whitney U檢驗(yàn)（兩組比較），計數(shù)資料的差異分析采用卡方檢驗(yàn)或 Fisher確切概率法；miR-93表達(dá)與臨床資料之間的相關(guān)性分析采用Spearman秩和檢驗(yàn)；生存時間分析采用 Kaplan-Meier法；用 Spearman相關(guān)系數(shù)分析 miR-93與 miR-378的相關(guān)性；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-93在兩組中的表達(dá)

16例對照的 miR-93表達(dá)水平在0.001316～1.000000（0.19±0.24）。因此，以0.43（均數(shù) +標(biāo)準(zhǔn)差）為界將 AML組分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。84 例AML患者中有14例（16.7％）為過表達(dá)miR-93。相應(yīng)對照組 miR-93的高表達(dá)率為6.25％（1/16）。對照組和 AML組的 miR-93的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

miR-93高表達(dá)組白細(xì)胞計數(shù)明顯低于低表達(dá)組（P=0.003），兩組其他參數(shù)如性別、年齡、血紅蛋白和血小板間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。AML組每個亞型都有 miR-93高表達(dá)的病例，但各型之間的高表達(dá)率無統(tǒng)計學(xué)意義。與其他核型分組［10/38（26.3％）］比較，中等預(yù)后組中 miR-93高表達(dá)的頻率明顯降低［4/46（8.7％），P=0.041］。

2.2 miR-93對預(yù)后的影響及與 miR-378的相關(guān)性

為了觀察AML患者中 miR-93高表達(dá)對患者預(yù)后的影響，我們對 84例患者中的 80例患者（失訪4例）進(jìn)行了生存分析，其中高表達(dá)組14例，低表達(dá)組66例。在完全緩解的43例中高表達(dá)組9例（64.3％），低表達(dá)組34例（51％）。兩組完全緩解率間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.566）。所有患者中，生存總?cè)藬?shù)為34例，其中高表達(dá)組6例，低表達(dá)組28例，兩組（又各有1例失訪）的總體生存率的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義［46％（6/13）與 43％（28/ 65），χ2=0.292，P=0.589］。在獲得完全緩解的AML患者中，miR-93高表達(dá)組和低表達(dá)組無復(fù)發(fā)生存率的差異也無統(tǒng)計學(xué)意義［75％（6/8）與84％ （27/32），χ2=0.341，P=0.559］。Spearman相關(guān)系數(shù)分析結(jié)果顯示，miR-93與miR-378之間有明顯相關(guān)性（r=0.321，P＜0.01）。見圖1。

表1 急性髓系白血病患者骨髓單個核細(xì)胞miR-93表達(dá)水平與臨床參數(shù)的關(guān)系

3 討論

AML的致病機(jī)制與染色體異常和蛋白編碼基因等密切相關(guān)。近年來，miRNA在 AML發(fā)生發(fā)展中的作用以及調(diào)控機(jī)制已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)之一。多數(shù)研究表明 miR-93能夠促進(jìn)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［3，8，13］。但miR-93在 AML中的作用機(jī)制還不明確。

圖1 Spearman相關(guān)系數(shù)分析miR-93與miR-378間的相關(guān)性

本研究測定了84例 AML患者以及16例對照的骨髓單個核細(xì)胞中miR-93的表達(dá)水平，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，84例AML患者中有14例為過表達(dá) miR-93（16.7％），提示 miR-93表達(dá)可能作為診斷AML的生物分子，今后需要更多病例進(jìn)行驗(yàn)證并進(jìn)行 miR-93與 AML的相關(guān)性研究。miR-93高表達(dá)組與低表達(dá)組相比，除了白細(xì)胞計數(shù)低以外（3.11×109/L與14.55×109/L，P=0.003），其他參數(shù)如性別、年齡、血紅蛋白和血小板間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。Zhu等［14-15］通過測定患者血清 中的miR-93以及其他一些微小RNA的表達(dá)水平，推斷可以將多種微小 RNA一起作為非小細(xì)胞肺癌和AML的分子診斷學(xué)依據(jù)。Spearman相關(guān)系數(shù)分析得出 miR-93與 miR-378具有正相關(guān)性（r=0.321，P＜0.01）。而我們以前的研究表明 miR-378對AML的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后可能有重大的意義［16］。miR-378和 miR-93已經(jīng)被證實(shí)與腫瘤的形成相關(guān)［3，9］。此次研究雖未有明確的數(shù)據(jù)證明 miR-93 對AML患者的預(yù)后有影響，但是miR-93與miR-378之間呈正相關(guān)，且在預(yù)后中等核型分組中 miR-93高表達(dá)的頻率更低。因此，我們認(rèn)為miR-93在AML中出現(xiàn)過表達(dá)及與 miR-378表達(dá)正相關(guān)，聯(lián)合檢測miR-93和miR-378的表達(dá)有可能作為 AML診斷的參考依據(jù)。

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Expression of miR-93 in AML and association between miR-93 and miR-378

TANG Qin1，2，YIN Jia-yu1，ZHU Xiao-wen1，ZHANG Ying-ying1，ZHOU Jing-dong1，DENG Zhao-qun3
（1.Department of Hematology，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002；2.Department Of Hematology，the Affiliated Jintan Hospital of Jiangsu University，Jintan Jiangsu 213200；3.Laboratory Centre，the Affiliated People′s Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212002，China）

R733.71

A

1671-7783（2015）01-0068-04

10.13312/j.issn.1671-7783.y140262

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81172595，81270630）；江蘇省臨床醫(yī)學(xué)科技專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目（BL2012056）；江蘇省“333工程”科研項(xiàng)目資助計劃（BRA2011085，BRA2013136）

湯琴（1972—），女，江蘇金壇人，碩士研究生；鄧兆群（通訊作者），副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail，dengqian2012@gmail.com

2014-10-10 ［編輯］陳海林