乙酸異戊酯高產(chǎn)菌脂肪酶的特性研究

譚才鄧，姚勇芳*，朱美娟，廖延智（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300）

乙酸異戊酯高產(chǎn)菌脂肪酶的特性研究

譚才鄧，姚勇芳*，朱美娟，廖延智
（廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 廣州 510300）

以乙酸異戊酯高產(chǎn)菌株Loq-c為試驗材料，從菌體中提取制備脂肪酶，研究其酶學(xué)特性，結(jié)果表明：該酶催化反應(yīng)的最適溫度在30℃左右，在40℃以下具有良好的熱穩(wěn)定性；催化體系的pH在6.0～7.0時，酶的相對活力和穩(wěn)定性較高，而當(dāng)pH≤4.0時酶表現(xiàn)得不穩(wěn)定，酶活力低。金屬離子Mg2+和Ca2+能明顯促進(jìn)酶的催化能力，Cu2+和Ag+能明顯抑制酶的催化能力，Na+、K+和Zn2+對酶催化的影響不顯著。正交試驗結(jié)果表明，菌株Loq-c脂肪酶最佳酶活條件為：溫度在30℃，pH值為7.0，Mg2+濃度為5.0 mmo1/L。在此最佳條件下，酶活力高達(dá)535.8 U/mL。

乙酸異戊酯；脂肪酶；酶學(xué)特性

脂肪酶（EC 3.1.1.3）普遍存在于動物、植物和微生物中［1-2］，能催化三酰甘油酯與其他酯類物質(zhì)的水解及合成反應(yīng)，此外還表現(xiàn)出一些其他酶的活性，如酰肽水解酶、磷脂酶活性等［3-4］，在糧油食品加工、日用化工、醫(yī)藥衛(wèi)生、環(huán)境保護(hù)和能源開發(fā)等許多工業(yè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用［6-7］。

脂肪酶有多個同工酶，其中種類最多的同工酶存在于微生物中［7-8］，如FICKERS P等［9］研究發(fā)現(xiàn)解脂耶氏酵母（Yarrowia 1ipo1ytica）能編碼合成16個脂肪酶同工酶。據(jù)統(tǒng)計，產(chǎn)脂肪酶的微生物多達(dá)65個屬，其中脂肪酶生產(chǎn)能力較強的菌株主要有黑曲霉（Aspergi11us niger）、根霉（Rhizopussp.）、粗狀假絲酵母（Candida va1ida）、假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、鏈霉菌（Streptomyces）等［6-8］，因此微生物脂肪酶是工業(yè)酶制劑的重要來源。菌株Loq-c是本實驗室分離獲得的一株高產(chǎn)乙酸異戊酯的克魯維畢赤酵母（Pichia k1uyveri），本研究初步從菌體中提取制備脂肪酶粗酶，研究其酶學(xué)特性，為菌株發(fā)酵生產(chǎn)乙酸異戊酯、菌種選育等提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌種

乙酸異戊酯生產(chǎn)菌Loq-c：由廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系實驗室篩選與保藏。

1.1.2主要試劑

酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；對硝基苯酚（p-nitropheno1，p-NP）、對硝基苯酚辛酸酯（p-nitropheno1 octoate，p-NPO）：美國Sigma公司；其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3培養(yǎng)基

酵母膏胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂粉2%，pH 7.0。

搖瓶培養(yǎng)基：葡萄糖10%，酵母粉4%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，pH 6.5。

1.2儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD型超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZWY-240型恒溫?fù)u床：上海智誠分析儀器制造有限公司；SC-3614型離心機：安徽中科中佳科學(xué)儀器公司；1-14K型離心機：德國Sigma公司；PHS-3C型pH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；752N型紫外可見分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；MK-20型干式恒溫器：杭州奧盛儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌體發(fā)酵培養(yǎng)

將菌種接種至平板（YEPD）培養(yǎng)基，28℃靜置培養(yǎng)48h。挑單菌落接種至裝液量為50 mL/250 mL搖瓶培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)18 h制備成種子液。以5%的接種量將種子液接種至裝液量為200 mL/1 000 mL新鮮搖瓶培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)16 h，用于粗酶液的制備。

1.3.2脂肪酶粗酶的制備［10-12］

取50 mL發(fā)酵液經(jīng)3 000 r/min離心5 min，菌體沉淀用5 mL 50 mmo1/L的Tris-HC1緩沖液（pH 6.5）懸浮，于研缽中添加適量石英砂研磨破碎5 min，3 000 r/min離心5 min，上清液即為粗酶液，置于4℃冰箱中保存，2 h內(nèi)使用。

1.3.3脂肪酶活力的測定［13-16］

采用p-NP法測定脂肪酶活力：取100 μL適宜濃度的粗酶液加入850 μL的50 mmo1/L Tris-HC1（pH 6.5）緩沖液中，混合均勻，28℃放置5min，加入50μL20mmo1/Lp-NPO作為底物，在28℃準(zhǔn)確反應(yīng)10min后，立即加入100μL1mo1/L的三氯乙酸終止反應(yīng)。將反應(yīng)液13 000 r/min離心5 min，取上清，在波長410 nm處測定吸光度值，同時繪制p-NP標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照下面方程式計算樣液中脂肪酶活力。酶活力單位定義為在pH6.5、28℃條件下，每分鐘釋放1μmo1p-NP的酶量為1個脂肪酶活力單位，U/mL。

相對酶活的測定：檢測粗酶液的活力，以測定的酶活性最大值作為100%，相對酶活為實際酶活除以最大酶活的百分?jǐn)?shù)，其計算公式如下：

1.3.4脂肪酶粗酶最適溫度試驗

將酶反應(yīng)體系分別在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃的溫度條件下進(jìn)行，比較不同溫度下脂肪酶粗酶的活力高低，確定最佳酶反應(yīng)溫度。

1.3.5脂肪酶粗酶熱穩(wěn)定性試驗

將適量的酶液分別為置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的溫度條件下保溫120 min，依次在0、20 min、40 min、60 min、80 min、100 min、120 min取樣，分別在不同溫度下測定酶活力，以測試酶液的熱穩(wěn)定性。

1.3.6脂肪酶粗酶最適pH試驗

將酶反應(yīng)體系分別在pH值為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的50 mmo1/L Tris-HC1緩沖液中進(jìn)行，比較不同pH體系下脂肪酶粗酶的活力高低，確定最佳酶反應(yīng)pH值。

1.3.7脂肪酶粗酶pH穩(wěn)定性試驗

將適量的酶液分別為置于pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的50 mmo1/L Tris-HC1緩沖液中，4℃放置60 min后，分別在不同pH值下測定酶活力，以測試酶液的pH穩(wěn)定性。

1.3.8金屬離子對脂肪酶活力的影響

選取NaC1、KC1、CaC12、ZnC12、FeC13、MgSO4、MnSO4、CuSO4、AgNO39種化合物添加到反應(yīng)體系中，使金屬離子的終濃度為5 mmo1/L。以不添加金屬離子的反應(yīng)體系為對照，測定不同金屬離子處理后脂肪酶的活力。

2　結(jié)果與分析

2.1酶反應(yīng)的最適溫度試驗

將粗酶液分別置于20～70℃的溫度條件進(jìn)行酶促反應(yīng)，以確定菌株Loq-c脂肪酶最佳反應(yīng)溫度，試驗結(jié)果見圖1。

圖1　溫度對酶活力的影響Fig.1 Effect of temperature on lipase activity

由圖1可知，反應(yīng)溫度在25～35℃時酶活力較高，酶活最高值出現(xiàn)在溫度30℃，為325.8 U/mL。當(dāng)反應(yīng)溫度＞40℃時，酶活力迅速降低，＞55℃后酶已基本失活。因此，可確定菌株Loq-c脂肪酶粗酶的最佳反應(yīng)溫度為30℃。

2.2酶的熱穩(wěn)定性試驗

為了探討菌株Loq-c脂肪酶對溫度的穩(wěn)定性，將粗酶液分別置于20～70℃的條件下保溫120 min，進(jìn)行酶活力測定，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，當(dāng)溫度＜40℃時，保溫60 min相對酶活保持在65%以上，保溫120 min相對酶活仍保持在50%以上。但當(dāng)溫度＞60℃時，相對酶活迅速下降，保溫60 min后相對酶活已在10%以下。表明該酶在40℃以下的溫度條件下具有較好的熱穩(wěn)定性。

圖2　溫度對酶穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on lipase stability

2.3酶反應(yīng)的最適pH試驗

將粗酶液分別置于pH值在3.0～10.0的反應(yīng)體系中進(jìn)行酶促反應(yīng)，以確定菌株Loq-c脂肪酶最佳反應(yīng)體系的pH值，試驗結(jié)果見圖3。

圖3　pH對酶活力的影響Fig.3 Effect of pH on lipase activity

由圖3可知，當(dāng)反應(yīng)體系的pH值較小時，相對酶活隨pH值的升高而升高，當(dāng)pH在6.5時相對酶活達(dá)到最高值，為338.8 U/mL；當(dāng)反應(yīng)體系的pH值＞6.5時，相對酶活隨pH值的升高反而降低；當(dāng)pH在6.0～7.0時，粗酶液的相對活力較高，在90%以上；當(dāng)pH＜5.0或pH＞8.0時，相對酶活急劇下降，酶表現(xiàn)得不穩(wěn)定，不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。結(jié)果表明，酶的反應(yīng)最佳pH值為6.5。

2.4酶的pH穩(wěn)定性試驗

為了探討菌株Loq-c脂肪酶對pH值的穩(wěn)定性，將粗酶液分別置于pH值在3.0～10.0的條件下處理60 min，進(jìn)行酶活力測定，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，pH值在6.0～7.0之間時酶比較穩(wěn)定，相對酶活在95%以上，而當(dāng)pH≤4.0時，相對酶活在20%以下，說明酸性環(huán)境下不利于此酶的保存。

圖4　pH對酶穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH on lipase stability

2.5金屬離子對酶活力影響試驗

在反應(yīng)體系中加入金屬鹽離子，使得金屬離子終濃度為5.0 mmo1/L，以不添加金屬離子的反應(yīng)體系為對照，以金屬離子處理條件下測得的酶活與對照組的酶活之比作為相對酶活，結(jié)果見圖5。

圖5　金屬離子對酶活力的影響Fig.5 Effect of metal ions on lipase activity

由圖5可知，Mg2+和Ca2+能明顯促進(jìn)酶的催化能力，比對照組相對酶活分別提高了52%和45%；Fe3+、Mn2+、Cu2+、Ag+能明顯抑制酶的催化能力，其中Cu2+和Ag+的抑制效果非常明顯，相對酶活只有對照組的20%和15%；Na+、K+和Zn2+對酶催化的影響不顯著。

2.6正交試驗優(yōu)化酶活條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，為了更好地研究溫度、pH值、金屬離子濃度的搭配組合對脂肪酶活力的影響，設(shè)計了3因素3水平的正交試驗，試驗因素與水平見表1，正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表1　產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for lipase production conditions optimization

表2　產(chǎn)酶條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for lipase production conditions optimization

表3　正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，酶活力影響因素依次為C＞A＞B，即Mg2+濃度為主要影響因素，其影響效果遠(yuǎn)高于溫度或pH值對酶活的影響，可認(rèn)為Mg2+為菌株Loq-c脂肪酶催化合成乙酸異戊酯的重要輔助因子。從各因子的k值可看出，最佳搭配組合為A2B3C2，而正交表中并未出現(xiàn)此組合，因此進(jìn)行驗證試驗，結(jié)果表明，在組合A2B3C2下脂肪酶粗酶液的活力達(dá)535.8U/mL，高于正交表中的最高組合A2B1C2（508.2U/mL）。因此，菌株Loq-c脂肪酶催化合成乙酸異戊酯的最佳條件為：溫度30℃，pH值7.0，Mg2+濃度5.0 mmo1/L。

由表3方差分析可知，金屬離子Mg2+濃度對酶活影響最大，對結(jié)果有顯著影響（P＜0.05），從F值可看出其影響效果遠(yuǎn)高于溫度或pH值，可認(rèn)為Mg2+為菌株Loq-c脂肪酶催化合成乙酸異戊酯的重要輔助因子。

3　結(jié)論

通過對乙酸異戊酯生產(chǎn)菌Loq-c脂肪酶粗酶液的特性研究，得到以下結(jié)論：該酶催化反應(yīng)的最適溫度在30℃左右，在40℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性，溫度超過40℃時酶活力較低。當(dāng)pH在6.0～7.0時，酶的相對活力較高，pH值在6.5時表現(xiàn)出最高酶活力；pH值在6.0～7.0之間時酶比較穩(wěn)定，相對活力在95%以上，而當(dāng)pH≤4.0時酶表現(xiàn)得不穩(wěn)定，酶活力很低。金屬離子Mg2+和Ca2+能明顯促進(jìn)酶的催化能力，Cu2+和Ag+能明顯抑制酶的催化能力，Na+、K+和Zn2+對酶催化的影響不顯著。經(jīng)過正交試驗，確定菌株Loq-c脂肪酶最佳酶活條件為：溫度30℃，pH值為7.0，Mg2+濃度為5.0 mmo1/L。在此最佳條件下，酶活力高達(dá)535.8 U/mL。

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Characteristics of 1ipase from isoamy1 acetate high-yie1d strain

TAN Caideng， YAO Yongfang*， ZHU Meijuan， LIAO Yanzhi
（Guangdong Industry Technica1 Co11ege， Guangzhou 510300， China）

The 1ipase was extracted from isoamy1 acetate high-yie1d strain Loq-c，and the enzyme characteristic was researched.Resu1ts indicated that the optimum temperature of the 1ipase was about 30℃.The 1ipase had good therma1 stabi1ity be1ow 40℃.When the pH of cata1ytic system was in the range of 6.0-7.0，the re1ative activity and stabi1ity of 1ipase was both higher，but when the pH was 1ess than or equa1 to 4.0，the re1ative activity and stabi1ity of 1ipase was both 1ower.The meta1 ion Mg2+and Ca2+cou1d promote the enzyme cata1ytic abi1ity significant1y，and Cu2+and Ag+cou1d inhibit the enzyme cata1ytic abi1ity significant1y，but Na+，K+and Zn2+had no significant inf1uence on enzyme cata1ytic.The orthogona1 experiments resu1ts showed that the optimum reaction conditions of the 1ipase from strain Loq-c was temperature 30℃，pH 7.0，Mg2+5.0 mmo1/L.Under the optimum conditions，the enzyme activity was up to 535.8 U/m1.

isoamy1 acetate；1ipase；enzymatic characteristics

Q55

A

0254-5071（2015）12-0060-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.013

2015-10-20

廣州市科技計劃項目（201510010113）；創(chuàng)新強校工程專項資金項目（1A20205）

譚才鄧（1980-），男，高級實驗師，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。

姚勇芳（1976-），男，副教授，碩士，研究方向為食品生物技術(shù)。