竹黃分離菌液態(tài)發(fā)酵條件及生物學(xué)活性研究

錢　驊，王　媛，周林芳，陳雙林，趙伯濤*（.南京野生植物綜合利用研究院江蘇 南京 004；.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 0097）

竹黃分離菌液態(tài)發(fā)酵條件及生物學(xué)活性研究

錢驊1，王媛2，周林芳2，陳雙林2，趙伯濤1*
（1.南京野生植物綜合利用研究院江蘇 南京 210042；2.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210097）

以竹黃分離菌株sh-3為試驗(yàn)材料，以生物量和紅色素產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件，并對(duì)發(fā)酵液的生物活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明，較優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件是20%馬鈴薯、0.03%MgSO4·7H2O、果糖3%、初始pH值為4、溫度28℃、裝液量120 mL/250 mL、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)時(shí)間6 d。在此最佳發(fā)酵條件下紅色素含量（OD529nm）為0.853。紅色素具有廣譜抑菌活性，對(duì)大腸桿菌（Escherichia co1i）最低抑菌濃度（MIC）0.158mg/mL，發(fā)酵液的正丁醇提取物具有較好的抗氧化活性和較強(qiáng)的抑制酪氨酸酶活性。

竹黃；分離菌；發(fā)酵條件；優(yōu)化；紅色素；生物活性

竹黃菌（Shiraia bambusico1aP.Henn.）是一種特異寄生在某些竹子嫩枝上的真菌，其子座稱竹黃，是我國一種珍貴的中藥資源。利用竹黃菌發(fā)酵生產(chǎn)或生物轉(zhuǎn)化出結(jié)構(gòu)新穎、生理活性獨(dú)特的天然生理活性物質(zhì)是一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。目前，對(duì)以產(chǎn)天然紅色素為目的竹黃菌液體培養(yǎng)研究報(bào)道較多，如用竹黃菌進(jìn)行液體發(fā)酵產(chǎn)蒽醌類色素［1］，用竹黃菌液體發(fā)酵生產(chǎn)竹紅菌素（苝醌類色素）［2-5］，陳佳佳等［6］用竹黃無性型菌株發(fā)酵產(chǎn)竹紅菌素，以及利用毛竹內(nèi)生菌［7］和菌寄生菌［8］液體發(fā)酵生產(chǎn)竹紅菌素報(bào)道。另外還有竹黃多糖［9］和以清除自由基為目標(biāo)的竹黃無性型菌株發(fā)酵條件優(yōu)化報(bào)道［10］。

本實(shí)驗(yàn)以竹黃中分離、篩選獲得的菌株sh-3為試驗(yàn)菌，采用單因素試驗(yàn)和4因素3水平正交試驗(yàn)法，以竹黃分離菌株sh-3菌絲體的生物量和次生代謝產(chǎn)物紅色素產(chǎn)量為考察指標(biāo)，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件，并對(duì)發(fā)酵液的各極性萃取部分進(jìn)行初步的生物活性測(cè)試，為竹黃菌發(fā)酵產(chǎn)物在食品、日化產(chǎn)品中的開發(fā)和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

竹黃分離菌株sh-3為竹黃子實(shí)體中分離菌株垣孢鐮刀霉（Fusarium ch1amydosporum）：由南京師范大學(xué)陳雙林教授鑒定并提供；大腸桿菌（Escherichea co1i）、金黃色葡萄球菌（Staphy1ococcusaureus）、青霉（Penici11iumcitrinum）、釀酒酵母（Saccharmoyces cerevisiae）、枯草芽孢桿菌（Baci11us subti1is）：本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯20%（馬鈴薯去皮后切成小塊，加水煮沸20 min后用四層紗布過濾得馬鈴薯汁），葡萄糖2%，蒸餾水定容和pH自然。固體培養(yǎng)基另含瓊脂2%。

營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯18.0 g，加蒸餾水1 000 mL，加熱溶解后調(diào)pH值7.4～7.6。營養(yǎng)肉湯固體培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中加18 g瓊脂。

1.1.3化學(xué)試劑

三吡啶三吖嗪（tripyridy1-triazine，TPTZ）；抗壞血酸、酪氨酸、熊果苷、二甲基亞砜（dimethy1 su1foxide，DMSO），均為分析純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

YXQ-LS-50SII立式高壓蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-1BU超凈工作臺(tái)：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SPX-70BIU恒溫培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；ZQLY-180恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；752紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1菌株sh-3菌種的活化及種子液的制備

菌種活化：將保藏的竹黃菌株sh-3接種于PDA平板培養(yǎng)基上，于26℃恒溫培養(yǎng)6 d，即得活化菌種。

種子液制備：用無菌打孔器在平板菌落上打孔（孔徑0.5 cm）挖取菌種，每瓶培養(yǎng)基接入菌株sh-3菌種1粒，PDA液體培養(yǎng)基裝液量50 mL/250 mL，恒溫振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150 r/min，26℃培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)6 d，即制得用于發(fā)酵的菌株sh-3液體菌種。

1.3.2分析測(cè)定

生物量：量取一定量的菌株sh-3液態(tài)發(fā)酵液，用布氏漏斗抽濾，菌絲體用蒸餾水洗滌3遍之后于80℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量，稱其質(zhì)量即得菌體生物量（g/100 mL）。

色素含量：取相同質(zhì)量的菌絲體干樣研磨，二氯甲烷超聲浸提、離心，上清液定容至一定體積，稀釋相同倍數(shù)，在最大吸收波長(zhǎng)（529 nm）條件下測(cè)吸光度值OD529nm。

1.3.3發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

在PDA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，分別改變①2%碳源（葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖）；②0.2%氮源（牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨和硫酸銨）；③0.03%金屬離子（Fe2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Cr3+）；④搖床轉(zhuǎn)速（120 r/min、150 r/min、180 r/min、210 r/min）；⑤培養(yǎng)時(shí)間（3 d、4 d、5 d、6 d、7 d）；⑥裝液量（60 mL/250 mL、80 mL/250 mL、100 mL/250 mL、120mL/250mL、150mL/250mL），測(cè)定OD529nm值和生物量。

以PDA基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對(duì)照，于26℃、裝液量120 mL/250 mL、轉(zhuǎn)速150 r/min條件下培養(yǎng)6 d，分別測(cè)定生物量（g/100 mL）和色素含量，重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在進(jìn)行了最佳碳源、氮源單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，為探討碳源、pH值、溫度、裝液量的相互交叉影響，試驗(yàn)中以生物量和色素產(chǎn)量為考察指標(biāo)，選取果糖添加量、pH值、溫度和裝液量進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)［10］，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.5紅色素提取溶劑篩選

菌株sh-3所產(chǎn)紅色素是菌絲體內(nèi)色素，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中紅色素存在于菌絲體或菌絲球中，未向培養(yǎng)液分泌紅色素。故提取紅色素所用材料是發(fā)酵液過濾所得濾渣（菌絲體），所得濾渣用水沖洗后，稱取6份，每份5 g；分別加相同體積（30 mL）的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、石油醚、甲醇、正己烷，考察提取溶劑對(duì)紅色素產(chǎn)量的影響。濾渣加石英砂研磨后，室溫超聲提取3次（20 kHz，100 W）20 min/次，濾液定容至相同體積，在最大吸收波長(zhǎng)529 nm處測(cè)定吸光度值OD529nm。二氯甲烷萃取效果最好，回收溶劑后得粗品紅色素。

1.3.6紅色素穩(wěn)定性試驗(yàn)

光照穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別取相同質(zhì)量濃度（1.0 mg/mL）的色素溶液置于黑暗、室內(nèi)散射光和室外陽光照射下處理8 h、間隔2 h取樣測(cè)定色素溶液光密度值OD529nm。

溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)：分別取相同質(zhì)量濃度（1.0 mg/mL）的色素溶液置于4℃、20℃、50℃、80℃、110℃處理8 h，間隔2 h測(cè)定色素溶液光密度值OD529nm。

1.3.7發(fā)酵代謝產(chǎn)物提取

將培養(yǎng)6d的菌株sh-3發(fā)酵液過濾所得濾渣，分別用二氯甲烷、正丁醇和體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇超聲（20 kHz、100 W）提取2次，第一次料液比1∶10（g∶mL），第二次1∶8（g∶mL），20 min/次。對(duì)濾液和上述各提取液濃縮、真空干燥得各代謝產(chǎn)物。取上述各代謝產(chǎn)物分別以二甲基亞砜溶解成1.9 mg/mL母液，備用。

1.3.8菌株sh-3發(fā)酵液的總抗氧化活性測(cè)定

菌株sh-3發(fā)酵液各提取物總抗氧化活性測(cè)定采用鐵離子還原法（ferric reducing abi1ity of p1asma，F(xiàn)RAP）［11-12］，即利用Fe3+吡啶三吖嗪可被樣品中還原物質(zhì)還原為Fe2+形式，呈現(xiàn)出藍(lán)色，并于波長(zhǎng)593 nm處具有最大光吸收，根據(jù)吸光度值計(jì)算樣品抗氧化活性的強(qiáng)弱。以每100 g提取物相當(dāng)于FeSO4的mmo1數(shù)為該提取物的FRAP值（FeSO4mmo1/100 g），F(xiàn)RAP值越大，由抗氧化物質(zhì)還原的Fe2+越多，即該物質(zhì)的抗氧化活性越強(qiáng)。陽性對(duì)照為維生素C（vitamin C，VC），1 mg/mL。

1.3.9竹黃菌發(fā)酵液的酪氨酸酶活性抑制作用

酪氨酸酶的活性與黑色素合成量相關(guān)，控制其活力即可控制黑色素生成量，從植物中分離天然酪氨酸酶抑制劑已得到人們的普遍關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)以L-酪氨酸為底物，從馬鈴薯中提取酪氨酸酶，以熊果苷為陽性對(duì)照，以不加受試液（樣品液或陽性對(duì)照）為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照。研究菌株sh-3各提取物對(duì)酪氨酸酶活性的影響。

［13］并依據(jù)濃度-酶抑制率曲線估計(jì)半數(shù)抑制濃度（IC50）的近似值。酪氨酸酶抑制率計(jì)算公式如下：

式中：A為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的吸光度值，B為受試液的吸光度值。

1.3.10菌株sh-3發(fā)酵液各提取物的抑菌活性測(cè)定［14-15］

各提取物抑菌活性測(cè)定采用濾紙片法，平板法確定該物質(zhì)的最低抑菌濃度（minima1 inhibitory concentration，MIC）。

取紅色素粗品以二甲基亞砜溶解，再按2倍稀釋法溶于PDA固體培養(yǎng)基中，使其終含量為0.317 mg/mL、0.158 mg/mL、0.079 mg/mL、0.040 mg/mL、0.02 mg/mL、0.01 mg/mL。分別接種等量的大腸桿菌懸液，并于37℃培養(yǎng)48 h，以無菌生長(zhǎng)的最低紅色素濃度為其MIC值。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2　結(jié)果與分析

2.1不同碳源對(duì)菌株sh-3液態(tài)發(fā)酵的影響

圖1　不同碳源對(duì)菌株sh-3生物量及紅色素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources on strain sh-3 biomass and red pigment yield

由圖1可知，乳糖的生物量（0.52 g/100 mL）和色素含量（OD529nm=0.088）最低，蔗糖、麥芽糖、葡萄糖和果糖的生物量相當(dāng)，約1 g/100 mL，但色素含量以果糖最高，OD529nm為1.75。發(fā)酵培養(yǎng)首要目的產(chǎn)物是紅色素，因此確定2%果糖為菌株sh-3液體培養(yǎng)的最佳碳源。

2.2不同氮源對(duì)菌株sh-3液態(tài)發(fā)酵的影響

由圖2可知，與對(duì)照相比，添加牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨后生物量提高約16.7%、17.0%和14.5%，添加硫酸銨則降低約10%；與空白對(duì)照相比，添加氮源后色素含量均降低，如添加牛肉膏、蛋白胨、硝酸銨和硫酸銨后OD529nm分別下降了33%、11%、68%和94%，添加無機(jī)氮源比添加有機(jī)氮源色素含量下降更多。因此確定菌株sh-3液體培養(yǎng)時(shí)不另外添加氮源。

圖2　不同氮源對(duì)菌株sh-3生物量和紅色素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources on strain sh-3 biomass and red pigment yield

2.3不同金屬離子對(duì)菌株sh-3液態(tài)發(fā)酵的影響

圖3　金屬離子對(duì)菌株sh-3生物量和紅色素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of metal ion on strain sh-3 biomass and red pigment yield

由圖3可知，與對(duì)照相比，添加金屬離子Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cr3+后生物量分別提高了14%、15%、5%和5%，添加Fe2+則下降約7%；與對(duì)照色素含量相比，添加Mg2+和Ca2+可明顯增加色素含量，提高約60%，添加Fe2+則與對(duì)照相同，添加Zn2+使色素含量下降36%，添加Cr3+后完全抑制色素產(chǎn)生。因此確定菌株sh-3液體培養(yǎng)時(shí)添加0.03%Mg2+。

2.4搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株sh-3液態(tài)發(fā)酵的影響

圖4　搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株sh-3生物量和紅色素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of shaking speed on strain sh-3 biomass and red pigment yield

搖床轉(zhuǎn)速也是影響培養(yǎng)基溶氧的一個(gè)重要因素，對(duì)菌株sh-3生長(zhǎng)產(chǎn)色素也有較大影響。由圖4可知，轉(zhuǎn)速過低時(shí)，對(duì)菌株sh-3生物量和色素產(chǎn)量影響都比較大，搖床轉(zhuǎn)速為120～150 r/min時(shí)，生物量隨轉(zhuǎn)速增加而增加，之后再加大搖床轉(zhuǎn)速，生物量基本不再增加；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為120～180 r/min時(shí)，sh-3色素產(chǎn)量隨轉(zhuǎn)速增加而增加轉(zhuǎn)速逐漸增大至180 r/min時(shí)，色素產(chǎn)量逐漸增大至最高值，隨后下降。因此確定搖床轉(zhuǎn)速180 r/min為最佳。

2.5培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株sh-3液態(tài)發(fā)酵的影響

圖5　培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株sh-3生物量及紅色素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of culture time on strain sh-3 biomass and red pigment yield

竹黃菌sh-3從發(fā)酵第3天開始菌絲體（球）顏色漸漸變紅，有紅色素形成，但發(fā)酵液不呈紅色，隨發(fā)酵時(shí)間的沿長(zhǎng)，菌絲體紅色加深，培養(yǎng)超過10 d后，發(fā)酵液開始呈現(xiàn)淺紅色。竹黃菌體內(nèi)色素含量隨培養(yǎng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化如圖6所示。由圖可知，培養(yǎng)6d時(shí)體內(nèi)色素產(chǎn)量達(dá)最高值，OD529nm為1.0，隨后呈下降趨勢(shì)，這可能是部分體內(nèi)色素開始轉(zhuǎn)化和向胞外分泌的原因，說明培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)并不利于色素的積累。在培養(yǎng)前5 d，生物量隨著培養(yǎng)時(shí)間增加而增加，在第5天時(shí)達(dá)最大值1.13 g/100 mL，此后不再增加。因此確定菌株sh-3的最佳培養(yǎng)時(shí)間為6 d。

2.6裝液量對(duì)菌株sh-3液態(tài)發(fā)酵的影響

圖6　裝液量對(duì)菌株sh-3生物量和紅色素產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of liquid volume on strain sh-3 biomass and red pigment yield

氧是細(xì)胞生長(zhǎng)的一個(gè)重要的因素，因而培養(yǎng)基中的溶氧對(duì)微生物的生長(zhǎng)及代謝起重要作用，本實(shí)驗(yàn)通過控制裝液量考察溶氧對(duì)菌絲體及色素產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，隨著裝液量的增加，菌株sh-3生物量呈遞增趨勢(shì)，說明菌絲體密度大，則生物量大；色素產(chǎn)量在120 mL/250 mL時(shí)達(dá)到最大值，超過120 mL/250 mL后色素產(chǎn)量下降，說明溶氧過低，不利于菌株sh-3紅色素的產(chǎn)生。相對(duì)于色素生成而言，生物量增長(zhǎng)對(duì)溶解氧需求較小。因此確定菌株sh-3液態(tài)培養(yǎng)的最佳裝液量為120 mL/250 mL。

2.7發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

表2　發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

由表2可知，以色素產(chǎn)量為考察指標(biāo)時(shí)，對(duì)色素產(chǎn)量影響大小的因素依次為B＞A＞C＞D，最佳因素組合為A3B1C3D2，即果糖3%、pH 4.0、溫度28℃、裝液量120 mL/250 mL；在該條件下液體發(fā)酵生產(chǎn)其生物量及色素產(chǎn)量分別為1.63 g/100 mL及0.853。以生物量為考察指標(biāo)時(shí)，對(duì)生物量影響大小的因素依次為D＞A＞B＞C，最佳因素組合為A3B1C1D3，即果糖3%、pH 4.0、溫度24℃、裝液量150 mL/250 mL。在該條件下液體發(fā)酵生產(chǎn)其生物量及色素產(chǎn)量分別為1.78 g/100 mL及0.764。綜合考慮，竹黃菌最佳發(fā)酵條件組合為A3B1C3D2，即果糖3%、pH 4.0、溫度28℃、裝液量120 mL/250 mL。

2.8紅色素的提取和生物活性測(cè)定

2.8.1紅色素提取

不同溶劑對(duì)菌株sh-3所產(chǎn)紅色素的提取效果提取效果由大至小依次為二氯甲烷＞乙酸乙酯＞正丁醇＞石油醚＞甲醇＞正己烷。二氯甲烷浸提液呈深紅色，而其它提取溶液顏色呈淺紅色，甚至近無色，說明紅色素易溶解于二氯甲烷中，如與乙酸乙酯相比，二氯甲烷提取液OD529nm提高340%，該色素在正己烷中完全不能溶解，幾乎不溶于甲醇，微溶于乙酸乙酯、正丁醇和石油醚，說明紅色素具有一定的親脂性，是一種弱極性紅色素。因此菌株sh-3紅色素提取溶劑宜用二氯甲烷提取。

2.8.2紅色素穩(wěn)定性試驗(yàn)

圖7　光照（A）及溫度（B）對(duì)竹黃菌紅色素穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of illumination（A）and temperature（B）on stability of S.Bambusicolared pigment

由圖7A可知，光照處理8 h后，室外陽光、室內(nèi)散射光和黑暗處理的OD529nm各下降了85%、24%和3%，紅色素在室外陽光下很不穩(wěn)定，室內(nèi)散射光下長(zhǎng)時(shí)間照射也使OD529nm下降，即紅色素對(duì)光很敏感，因此紅色素需要避光保存。

由圖7B可知，4℃、20℃、50℃、80℃、110℃溫度分別處理8 h后，OD529 nm分別下降了1.1%、1.7%、2.8%、4.2%和5.9%，紅色素對(duì)溫度不敏感，即使高溫長(zhǎng)時(shí)間仍穩(wěn)定。

2.9菌株sh-3各提取物的抗氧化活性

還原能力可間接反映活性物質(zhì)的抗氧化性質(zhì)，本試驗(yàn)以還原力表示活性物質(zhì)抗氧化活性，F(xiàn)RAP法測(cè)定各提取物的總抗氧化活性結(jié)果如表3所示。

由表3可知，濾過液、體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇提取液、正丁醇提取液和二氯甲烷提取液均有一定的抗氧化活性，抗氧化活性大小依次為正丁醇＞濾過液＞體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇＞二氯甲烷提取液，但與陽性對(duì)照VC相比，各提取物的總抗氧化活性均較弱。說明sh-3代謝產(chǎn)物的主要抗氧化成分存在于正丁醇提取物中。

表3　各提取物的體外總抗氧化活性FRAP法測(cè)定結(jié)果Table 3 Total antioxidative activities of extract from strain sh-3 fermentation broth measured by FRAP method

2.10竹黃菌各提取物的酪氨酸酶活性抑制作用

以樣品溶液在反應(yīng)體系中的終濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)酪氨酸酶的抑制率為縱坐標(biāo)繪制濃度-酶抑制率曲線，結(jié)果見圖8。

圖8　竹黃分離菌發(fā)酵液各萃取物對(duì)酪氨酸酶活性的抑制作用Fig.8 Inhibitory effect of each extract fromS.Bambusicola fermentation liquor on the activity of tyrosinase

由圖8可知，竹黃分離菌各提取物對(duì)酪氨酸酶活性均有抑制作用，提取物質(zhì)量濃度增加而提高，呈濃度效應(yīng)。各提取物相同抑制率下的作用濃度和半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration，IC50）值，竹黃分離菌各提取物對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用由強(qiáng)至弱依次為正丁醇＞熊果苷＞70%乙醇＞二氯甲烷＞濾過液，且濾過液的酪氨酸酶抑制活性在樣液濃度0.2～1.0 mg/mL均低于50%，即其IC50＞1.0 mg/mL，即其對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用最小。因此對(duì)酪氨酸酶活性起主要抑制作用的是正丁醇提取物。

2.11竹黃分離菌各提取物的抑菌活性測(cè)定

表4　竹黃分離菌發(fā)酵液各提取物的抑菌效果Table 4 Inhibitory effect of each extract fromS.Bambusicola fermentation liquormm

濾紙片法測(cè)定竹黃分離菌各提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、青霉和酵母菌的抑菌效果如表4所示。

由表4可知，二氯甲烷提取液對(duì)上述5種菌均有抑菌作用，且對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好，發(fā)酵濾過液無抑菌作用，體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇和正丁醇提取物只對(duì)大腸桿菌有抑菌作用。進(jìn)一步用倍比稀釋法測(cè)定二氯甲烷提取物對(duì)大腸桿菌的最低抑菌濃度（MIC）是0.158 mg/mL。

3　結(jié)論

本研究對(duì)菌株sh-3液體發(fā)酵生成紅色素條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化條為：馬鈴薯20%、MgSO4·7H2O 0.03%、果糖3%、pH 4.0、溫度28℃、裝液量120 mL/250 mL、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min培養(yǎng)時(shí)間6 d。在此最佳條件下，紅色素含量（OD529nm）為0.853。紅色素在室外陽光照射下不穩(wěn)定，對(duì)溫度不敏感，儲(chǔ)存時(shí)要避光保存。菌株sh-3發(fā)酵液代謝產(chǎn)物正丁醇提取物有良好抗氧化和抑制酪氨酸酶活性作用，紅色素的抗菌活性最強(qiáng)，其在藥用和化妝品行業(yè)中具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。

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Liquid fermentation conditions and bioactivities of the strain iso1ated fromShiraia bambusico1a

QIAN Hua1，WANG Yuan2，ZHOU Linfang2，CHENG Shuang1in2，ZHAO Botao1*
（1.Nanjing Institute for the Comprehensive Uti1ization of Wi1d P1ant，Nanjing 210042，China；2.Schoo1 of Life Science，Nanjing Norma1 University，Nanjing 210097，China）

Using strain sh-3 iso1ated fromShiraia bambusico1aas test materia1，the biomass and red pigment yie1d as eva1uation index，the fermentation conditions were optimized by sing1e factor experiments and orthogona1 experiments，and the bioactivities of fermentation 1iquor were researched.Resu1ts indicated that the optimum fermentation conditions were potato 20%，MgSO4·7H2O 0.03%，fructose 3.0%，initia1 pH 4.0，temperature 28℃，1iquid vo1ume 120 m1/250 m1，shaking speed 180 r/min，cu1ture time 6 d.Under the optimum fermentation conditions，the yie1d of red pigment （OD529 nm）was 0.853.The red pigment had broad-spectrum antibacteria1 activity；the minima1 inhibitory concentration of red pigment onEscherichia co1iwas 0.158 mg/m1.The n-butano1 extracted from fermentation 1iquor had good antioxidant activity and inhibition of tyrosinase activity.

Shiraia bambusico1a；iso1ated strain；fermentation conditions；optimization；red pigment；bio1ogica1 activity

TQ920.1

A

0254-5071（2015）12-0038-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.009

2015-10-20

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技支撐計(jì)劃課題（2012BAD36B0502）

錢驊（1966-），女，研究員，碩士，主要從事植物資源、植物生理等方向的研究與開發(fā)工作。

趙伯濤（1962-），男，研究員，本科，主要從事植物資源評(píng)價(jià)與植物化學(xué)方向研究。