紅曲酸奶中乳酸菌變化情況研究

王智耀，肖昌貴，倪　莉，張　雯，陳智超，劉志彬*（福州大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)研究所，福建 福州 350108）

紅曲酸奶中乳酸菌變化情況研究

王智耀，肖昌貴，倪莉，張雯，陳智超，劉志彬*
（福州大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)研究所，福建 福州 350108）

利用超聲波浸提法提取紅曲中的有效成分，將紅曲水提取液與全脂奶粉混合發(fā)酵制成新型紅曲酸奶。通過熒光原位雜交（FISH）技術(shù)跟蹤發(fā)酵過程中乳酸菌含量的變化，結(jié)果表明：紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌數(shù)量顯著高于普通酸奶。發(fā)酵2 h時，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量分別為普通酸奶的2.63和2.24倍；發(fā)酵5 h時，發(fā)酵接近終點，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量分別為普通酸奶的2.29和2.75倍。紅曲酸奶的保藏期可達15 d，乳酸菌數(shù)符合國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。

乳酸菌；熒光原位雜交；紅曲酸奶

紅曲又名赤曲、丹曲、紅米，常以秈稻、粳米為主要原料，接種紅曲霉發(fā)酵后制成，具有消食活血、健脾燥胃的功效［1］。紅曲除用于肉制品著色和腐乳等行業(yè)外，作為一種性能優(yōu)良的糖化劑，也被廣泛地應(yīng)用在釀酒等飲品產(chǎn)業(yè)中，在食品領(lǐng)域占有重要的地位［2］。乳酸菌被認(rèn)是乳制品中應(yīng)用最為廣泛的細(xì)菌［3］，大多數(shù)乳酸菌為革蘭氏陽性桿菌或球菌。酸奶生產(chǎn)中常用嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophi1us）和保加利亞乳桿菌（Lactobaci11us bu1garicus）作為混合發(fā)酵劑，接種到發(fā)酵基料中進行酸奶制作［4］。研究表明，紅曲與酸奶結(jié)合后可改善乳酸菌發(fā)酵環(huán)境，促進發(fā)酵體系內(nèi)乳酸菌的生長［7］，從而改變酸奶最終的風(fēng)味及營養(yǎng)成分，提升其口感與品質(zhì)。

熒光原位雜交（f1uorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)可將熒光標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針與菌體細(xì)胞內(nèi)的特異rRNA片段雜交，通過熒光的激發(fā)達到檢測目的［8］。該方法的使用，不需對待測菌體進行提前培養(yǎng)，對不可培養(yǎng)的菌體，能快速且準(zhǔn)確地測定其變化情況。本研究通過對紅曲米提取物、混合發(fā)酵劑混合全脂奶粉作為發(fā)酵基料，制成新型紅曲酸奶。結(jié)合熒光原位雜交（FISH）技術(shù)［9］，分析不同發(fā)酵時間乳酸菌含量變化，探討紅曲對乳酸菌生長的影響，為紅曲酸奶的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

全脂奶粉：光明乳業(yè)有限公司；紅曲米：市售；酸奶濃縮凍干發(fā)酵劑（嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophi1us）2×1011CFU/g、保加利亞乳桿菌（Lactobaci11us bu1garicus）5×1010CFU/g）：杜邦丹尼斯克公司；白砂糖：太古糖業(yè)（中國）有限公司。

草酸銨、番紅、NaC1、KC1、Tris、HC1、乙二胺四乙酸、KH2PO4、K2HPO4等試劑均為國產(chǎn)分析純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；溶菌酶、多聚甲醛、去離子甲酰胺等：上海生工生物工程有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

GTTP02500型0.2μm聚碳酸酯濾膜：默克密理博公司；2000S型熒光顯微鏡：日本尼康公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

熒光實驗選用EUB338探針。探針的5’端上標(biāo)記A1exa F1uor488染料，染料在藍色激發(fā)波長下發(fā)出綠光，由上海生工合成。探針EUB338序列為GCTGCCTCCCGTAGGAGT （5’-3’），其中GC含量為66.67%，溫度為61.86℃。

1.3方法

1.3.1紅曲酸奶制備的工藝流程及操作要點

紅曲米的前處理：紅曲米經(jīng)粉碎機磨碎并過80目篩，得到紅曲米粉；在紅曲米粉中加入蒸餾水，在超聲裝置中處理20 min，充分提取紅曲米中的營養(yǎng)成分［10］；超聲波處理后在室溫條件下充分浸提2 h，浸提過程持續(xù)攪拌；將所得到的溶液進行過濾，即得紅曲水提液。

發(fā)酵劑的制備：將嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌以1∶1的比例，接種到經(jīng)過121℃、5 min滅菌處理后冷卻的脫脂奶培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，全過程于無菌超凈工作臺操作。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以充分活化乳酸菌；培養(yǎng)后培養(yǎng)基置于4℃保存，待用［11］。

1.3.2紅曲酸奶的發(fā)酵工藝

在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的全脂奶粉中，依次加入紅曲水提液、8%的蔗糖以及0.1%的復(fù)合穩(wěn)定劑，在無菌操作臺內(nèi)室溫水化2 h，充分溶解，得到發(fā)酵液；將發(fā)酵液分裝到滅菌瓶中，在90℃水浴保溫5min；待發(fā)酵液冷卻至37～43℃時，添加酸奶發(fā)酵劑，接種后不斷攪拌2 min，使菌種均勻分布于滅菌瓶中；43℃恒溫發(fā)酵，直至pH值為4.3～4.5，或滴定酸度在70～80°T；將滅菌瓶置于無菌操作臺冷卻至室溫，移入4℃冰箱中后熟12～24 h，即得紅曲酸奶［11］。

1.3.3熒光原位雜交法（FISH）實驗

（1）熒光原位雜交實驗流程

取樣固定→酒精保存→細(xì)胞壁通透→探針雜交→制片→熒光鏡檢

（2）乳酸菌熒光鏡片制備

取100 μL待測酸乳液，置于1.5 mL離心管中，在10 000 r/min下離心5 min，去上清，收集沉淀；往收集的沉淀中加入10 μL 1×磷酸鹽緩沖液重懸，再加入30 μL 4%多聚甲醛，放入4℃冰箱靜置固定1 h；1 h后由冰箱取出離心管加入40 μL無水乙醇，在-20℃冰箱中儲存0.5 h以上；取8 μL上述菌液，加入42.5 μL 0.01 mo1/L Tris-HC1溶液和2.5 μL 20 mg/mL溶菌酶溶液，混合均勻；往離心管中加入20 μL 5×雜交液、22 μL去離子甲酰胺以及5 μL的EUB338探針（黑暗條件下加入，防止淬滅），輕輕重懸，置于46℃下雜交1 h；取雜交后的液體在0.2 μm聚碳酸酯濾膜上真空過濾，滴加12 μL抗熒光淬滅劑，封片。

（3）熒光鏡檢

將制得鏡片置于熒光顯微鏡下進行觀察，藍色光激發(fā)熒光。隨機選取熒光顯微鏡內(nèi)觀察5個視野，取其平均數(shù)，菌體細(xì)胞數(shù)按照下列公式計算：

其中，因?qū)嶒炦x用過濾半徑為8.4mm的聚碳酸酯濾膜，其過濾面積S=π×8 4002≈2.22×108μm2；觀察的視野面積為118×89.2=1.05×104μm2。

1.3.4酸奶的保藏期實驗

將4℃冰箱中裝有制成紅曲酸奶的無菌瓶取出，無菌條件下進行取樣操作，完成乳酸菌熒光鏡片制備。取樣時間［12］分別為1 d、2 d、7 d、8 d、11 d、12 d、13 d、14 d，取樣完成后將無菌瓶放回冰箱。

2　結(jié)果與分析

2.1FISH法觀察發(fā)酵過程中的乳酸菌

采用熒光原位雜交（FISH）法跟蹤酸奶發(fā)酵過程中的乳酸菌變化，跟蹤時間分別為1 h、3 h、5 h，通過熒光鏡檢圖片觀察發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)的變化，結(jié)果見圖1。

圖1　酸奶發(fā)酵1 h、3 h、5 h乳酸菌數(shù)變化情況Fig.1 Change of lactic acid bacteria count of yogurt by fermentation for 1 h，3 h，5 h

圖1熒光視野中存在的兩種菌分別為長桿型保加利亞乳桿菌和球型嗜熱鏈球菌。其中圖1A、1C、1E為普通酸奶發(fā)酵1 h、3 h、5 h FISH圖（稀釋倍數(shù)分為10、50、500倍）；圖1B、1D、1F為紅曲酸奶發(fā)酵1 h、3 h、5 h FISH圖（稀釋倍數(shù)分為10、50、500倍）。由圖1可知，隨發(fā)酵時間的增加，兩種酸奶中總?cè)樗峋鷶?shù)均呈上升趨勢。

2.2兩種酸奶發(fā)酵過程乳酸菌的變化對比

對發(fā)酵時間為0～6 h的普通酸奶和紅曲酸奶中的乳酸菌進行計數(shù)，結(jié)果見表1、表2。

表1　普通酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的菌體細(xì)胞對數(shù)值Table 1 The colony count logarithm ofStreptococcus thermophilus andLactobacillus bulgaricusin normal yogurt

表2　紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的菌體細(xì)胞對數(shù)值Table 2 The colony count logarithm ofStreptococcus thermophilus andLactobacillus bulgaricusin red kojic rice yogurt

綜合表1和表2可知，發(fā)酵1 h時，兩種酸奶所測定的菌數(shù)量基本不變。延滯期時，菌體的細(xì)胞數(shù)目變化緩慢，菌體分裂幾乎處在一個停止的狀態(tài)［13］，判斷此時球菌和桿菌處于延滯期，幾乎不生長。發(fā)酵2～3 h時，菌體細(xì)胞數(shù)目開始增加，此時嗜熱鏈球菌的增長速率快于保加利亞乳桿菌，菌體細(xì)胞數(shù)目更多，該時期嗜熱鏈球菌是主要的產(chǎn)酸菌株［14］，這一結(jié)果與郭本恒等［15］認(rèn)為的球菌率先進入對數(shù)生長期的結(jié)論一致。

PUTTANANJAIAH M K H等［7］發(fā)現(xiàn)，紅曲提取物可以激活和提高β-半乳糖苷酶的活性，使體系內(nèi)乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸的速率增快，進而促進乳酸菌的生長。統(tǒng)計分析發(fā)酵過程中兩種酸奶乳酸菌的菌量變化，發(fā)酵1 h時，兩種酸奶的保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌數(shù)目基本相同，處于生長的延滯期。隨著發(fā)酵時間的增加，紅曲酸奶適應(yīng)發(fā)酵環(huán)境所用的時間少，更早進入對數(shù)生長期，發(fā)酵2h時，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量分別為普通酸奶的2.63和2.24倍。發(fā)酵5 h時，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量分別為普通酸奶的2.29和2.75倍。發(fā)酵全程，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量均高于普通酸奶。

2.3紅曲酸奶保藏期研究

分析統(tǒng)計紅曲酸奶發(fā)酵期間乳酸菌含量變化，以探究其保藏期，結(jié)果見表3。

表3　紅曲酸奶保藏期間乳酸菌變化情況Table 3 Changes of lactic acid bacteria in red kojic rice yogurt during shelf-life

從表3中可以看出，保藏期達15 d時，紅曲酸奶中乳酸菌含量＞106CFU/mL，符合國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302—2010《發(fā)酵乳》對酸奶中活性乳酸菌含量的要求。因此可說明紅曲酸奶保藏期可達15 d。

3　結(jié)論

應(yīng)用熒光原位雜交（FISH）技術(shù)對酸奶中的保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進行計數(shù)。結(jié)果表明，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌數(shù)量顯著高于普通酸奶。當(dāng)發(fā)酵2 h時，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數(shù)量分別為普通酸奶的2.63和2.24倍；發(fā)酵進行至5 h，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量分別為普通酸奶的2.29和2.75倍。在發(fā)酵全部過程中，紅曲酸奶中保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌菌體數(shù)量均多于普通酸奶，說明紅曲米浸提液對乳酸菌的生長有一定的促進作用。經(jīng)保藏15 d，紅曲酸奶中乳酸菌含量＞106CFU/mL，滿足國標(biāo)相關(guān)要求，說明該紅曲酸奶保藏期可達15 d。

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Changes of 1actic acid bacteria in red kojic rice yogurt

WANG Zhiyao，XIAO Changgui，NI Li，ZHANG Wen，CHEN Zhichao，LIU Zhibin* （Institute of Food Science and Techno1ogy，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou 350108，China）

The active ingredient of red kojic rice was extracted by u1trasound-assisted method and its water extract was mixed with who1e mi1k powder to ferment a nove1 red kojic rice yogurt.The changes of 1actic acid bacteria during the yogurt fermentation with or without red kojic rice extract were detected by f1uorescence in situ hybridization method.Resu1ts showed thatLactobaci11us bu1garicusandStreptococcus thermophi1uscount in red kojic rice yogurt was significant1y higher than that in norma1 yogurt，when the fermentation time was 2 h，the resu1ts indicated that the 1ogarithm numbers ofL.bu1garicusandS.thermophi1uscounts in red kojic rice yogurt were 2.63 and 2.24 times of norma1 yogurt，respective1y.When fermentation time was 5 h，the process was c1osed to the end，and the 1ogarithm numbers ofL.bu1garicusandS.thermophi1uscounts in red kojic rice yogurt were 2.29 and 2.75 times of those in the contro1，respective1y.The she1f 1ife of the red kojic rice yogurt cou1d reach 15 d and the 1actic acid bacteria count met the requirement of the nationa1 food safety standard of the fermented mi1k.

1actic acid bacteria；FISH；red kojic rice yogurt

TS201.3

A

0254-5071（2015）12-0020-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.12.005

2015-10-10

國家自然科學(xué)基金（31371820，31171733）

王智耀（1992-），男，碩士研究生，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

劉志彬（1982-），男，助理研究員，博士，研究方向為食品生物技術(shù)。