EP14－A3文件在試劑內(nèi)源性抗體干擾研究中的應(yīng)用

張 娟，韋 清，劉君君

（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，廣東深圳518057）

免疫分析法以其高靈敏度和特異度在臨床檢測(cè)中得到廣泛的應(yīng)用。然而，這項(xiàng)以抗原－抗體反應(yīng)作為基本原理的技術(shù)，必然會(huì)受到內(nèi)源抗體干擾影響［1］。據(jù)報(bào)道，內(nèi)源性抗體干擾發(fā)生率為1%～40%，甚至更多（與受檢人群及檢測(cè)技術(shù)有關(guān)）［2－4］。隨著干擾阻斷劑技術(shù)的應(yīng)用，干擾發(fā)生率降至2%以下［3，5］。干擾可導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假性升高或降低，甚至假陽(yáng)性或漏檢，影響臨床醫(yī)生對(duì)疾病的診斷及病情評(píng)估，可能給患者帶來(lái)不必要的檢查和錯(cuò)誤用藥［6］，還可能貽誤病情使其錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)期。內(nèi)源性干擾抗體一般包括：嗜異性抗體，如類風(fēng)濕因子（RF）、抗核抗體（ANA）；人抗動(dòng)物抗體，如人抗鼠抗體HAMA；自身免 疫 性 抗 體，如 抗 甲 狀 腺 素 抗 體（anti－Tg）［1，7］。其中，嗜異性抗體特異性低、能與多種物種抗體結(jié)合，是內(nèi)源性抗體干擾中最常見(jiàn)的一類；人抗動(dòng)物抗體和自身免疫性抗體因其抗體高度特異性，對(duì)結(jié)果造成的干擾程度則分別與檢測(cè)試劑盒采用何種動(dòng)物的抗體及項(xiàng)目特異性有關(guān)。自20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)免疫干擾后，一系列檢測(cè)和消除干擾抗體的方法（稀釋后是否線性、更換檢測(cè)方法、抗體中和、干擾抗體移除、添加阻斷劑等）應(yīng)運(yùn)而生［1，7－8］。這些方法并不能完全避免干擾，均為結(jié)果出現(xiàn)異常后對(duì)樣品的一種事后回溯手段［1］，而且針對(duì)的往往是單個(gè)樣品的研究，缺少臨床多個(gè)樣品的比較。本文運(yùn)用EP14－A3［9］中描述的方法，選用市場(chǎng)上廣泛應(yīng)用、口碑較好的廠商試劑作為參比系統(tǒng)，以化學(xué)發(fā)光免疫方法和內(nèi)源性抗體RF干擾為例，從試劑盒自身抗干擾能力角度出發(fā)，提供一種綜合評(píng)估試劑盒抗干擾能力的方法，為臨床和試劑研發(fā)中評(píng)估抗內(nèi)源性抗體干擾能力提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 儀器：邁瑞CL－2000i全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，羅氏Cobas e411全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，貝克曼ACCESSⅡ全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀。試劑：在研試劑盒A（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）及配套校準(zhǔn)、質(zhì)控品；參比試劑為羅氏硫酸脫氫表雄甾酮（DHEA－S）檢測(cè)試劑盒（電化學(xué)發(fā)光法）及配套校準(zhǔn)品；在研試劑盒B（化學(xué)發(fā)光免疫分析法）及配套校準(zhǔn)、質(zhì)控品；參比試劑為貝克曼甲狀腺球蛋白（Tg）測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光法）及配套校準(zhǔn)品。試劑主要成分和原理見(jiàn)表1。

表1 試劑盒基本信息

續(xù)表1 試劑盒基本信息

1.2 方法

1.2.1 樣品準(zhǔn)備 35份正常血清樣品，12份不同濃度的RF血清樣品，正常血清樣品的DHEA－S和Tg濃度盡量覆蓋RF血清樣品所含的DHEA－S和Tg濃度。

1.2.2 測(cè)試 測(cè)試前通過(guò)質(zhì)控測(cè)定確保系統(tǒng)穩(wěn)定。按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行準(zhǔn)備，將RF 干擾樣品隨機(jī)穿插在正常血清樣品中，將樣品先用待評(píng)估試劑在邁瑞CL－2000i全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀上測(cè)2 次，再用參比試劑分別在對(duì)應(yīng)儀器上測(cè)2次。分別記錄測(cè)試結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 按EP9－A3方法［10］對(duì)重復(fù)測(cè)定結(jié)果離群點(diǎn)進(jìn)行剔除，以對(duì)比系統(tǒng)測(cè)值的均值為橫坐標(biāo)，待評(píng)價(jià)系統(tǒng)測(cè)值的均值為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖，用JMP9.0軟件判斷是否適合線性回歸。若呈線性，則以的均值為橫坐標(biāo)，以為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖，觀察散點(diǎn)的分散度是否隨橫坐標(biāo)濃度值的遞增而遞增（呈喇叭狀）。若遞增，則需將分別轉(zhuǎn)換成和，繪制新散點(diǎn)圖。運(yùn)用MedCalc軟件對(duì)正常樣品散點(diǎn)圖進(jìn)行戴明回歸分析，得到斜率和截距根據(jù)擬合的戴明回歸曲線，對(duì)已給定的值可以計(jì)算出一個(gè)預(yù)期的值，按公式計(jì)算的95%置信區(qū)間，式中：γ 為Ⅰ型錯(cuò)誤發(fā)生概率（一般為0.05），n 為 樣本量；NH為測(cè)試 重復(fù) 次數(shù)為戴明 回歸線的標(biāo) 準(zhǔn)差［9］。最 后，以為橫坐標(biāo)，為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖，將散點(diǎn)分別連線后即得到正常樣品單值95%置信區(qū)間的上下限曲線。

2 結(jié) 果

2.1 戴明回歸分析前數(shù)據(jù)處理 運(yùn)用JMP9.0 軟件對(duì)DHEA－S和Tg正常樣品散點(diǎn)分別進(jìn)行二次、一次方回歸分析，見(jiàn)表2、3，只有一次項(xiàng)系數(shù)與0 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），因此按線性模型回歸。以的均值為橫坐標(biāo)，以為縱坐標(biāo)，分別對(duì)DHEA－S和Tg正常樣品繪制散點(diǎn)圖，見(jiàn)圖1、2（見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”），散點(diǎn)的分散度沒(méi)有隨橫坐標(biāo)濃度值的遞增而遞增，因此均無(wú)需進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換。

表2 JMP9.0對(duì)DHEA－S正常樣本回歸系數(shù)的分析（n＝35）

表3 JMP9.0對(duì)Tg正常樣本回歸系數(shù)的分析（n＝35）

2.2 戴明回歸和干擾判斷 對(duì)正常樣品散點(diǎn)圖進(jìn)行戴明回歸分析，得到斜率和截距。根據(jù)擬合的戴明回歸結(jié)果，繪制正常樣品單值95%置信區(qū)間上下限曲線如圖3、4（見(jiàn)《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”）中虛線所示。在圖3中，RF 樣品已超出95%置信區(qū)間上限，說(shuō)明在研試劑A 抗RF 干擾能力較弱，在RF樣品識(shí)別上與參比試劑存在明顯差異性。圖4中，RF樣品與正常樣品聚合較好，RF樣品均處于95%置信區(qū)間以內(nèi)，說(shuō)明在研試劑B與參比試劑抗RF干擾能力相當(dāng)。

3 討 論

本文運(yùn)用EP14－A3方法評(píng)估了兩種化學(xué)發(fā)光試劑盒的抗內(nèi)源性抗體干擾能力。結(jié)果顯示，RF對(duì)在研試劑A 整體表現(xiàn)為正干擾，對(duì)在研試劑B的干擾不明顯。RF是一類易與變性IgG 的Fc段非特異結(jié)合的自身抗體，不具種屬特異性［7］，以上評(píng)價(jià)結(jié)果從試劑開(kāi)發(fā)原理上分析，在研試劑A 采用競(jìng)爭(zhēng)法二抗體系且二抗為多克隆兔抗，多克隆兔抗含有的多種IgG Fc段易與RF結(jié)合，而使標(biāo)記抗原不能與捕獲抗體相連，導(dǎo)致發(fā)光值假性降低，測(cè)值偏高，表現(xiàn)為明顯的正干擾。而RF 對(duì)在研試劑B干擾不明顯可能與試劑B 所用抗體為單克隆抗體、RF結(jié)合位點(diǎn)少，且試劑抗干擾配方優(yōu)化較好有關(guān)。

從圖3、4標(biāo)出的RF濃度可知，干擾物的濃度與干擾程度并不呈正比，該結(jié)論與陳金超等［11］的報(bào)道一致。由于RF有多種類型（如IgM、IgG 及IgA），濃度相同但種類不同的RF對(duì)檢測(cè)的干擾程度可能并不相同［12］。此外，血清成分復(fù)雜，低濃度的RF干擾樣品中可能還存在其他未知干擾物（如其他干擾抗體、代謝物、藥物等）。因此，僅以少數(shù)幾份樣品得到的結(jié)果往往相互矛盾，不足以評(píng)價(jià)干擾，評(píng)估抗體干擾應(yīng)建立在一定統(tǒng)計(jì)量的基礎(chǔ)上。

EP14－A3是用于評(píng)價(jià)處理樣品與血清樣品基質(zhì)效應(yīng)的指導(dǎo)性文件。內(nèi)源性抗體干擾導(dǎo)致的結(jié)果就是基質(zhì)差異。本文探討了EP14－A3方法應(yīng)用于內(nèi)源性抗體干擾評(píng)估中的可操作性。這種方法側(cè)重于臨床多樣本研究，在一定統(tǒng)計(jì)量基礎(chǔ)上評(píng)估了試劑RF干擾的風(fēng)險(xiǎn)，可作為一種簡(jiǎn)便、直觀的試劑配方篩選補(bǔ)充手段，一定程度上對(duì)國(guó)內(nèi)試劑研發(fā)中配方篩選和體系優(yōu)化提出更高要求，為在研試劑完善提供方向和目標(biāo)，同時(shí)也為臨床醫(yī)院選取和評(píng)估待引進(jìn)試劑提供了科學(xué)建議。該方法以參考方法為標(biāo)準(zhǔn)，使用也有前提：（1）方法學(xué)比對(duì)指標(biāo)優(yōu)良；（2）對(duì)比系統(tǒng)或參考方法的抗干擾能力臨床認(rèn)可度高。若能滿足上述條件，EP14－A3 是科學(xué)、直觀的內(nèi)源性抗體干擾評(píng)估方法。

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