過氧乙酸對脫細胞血管支架生物學(xué)特性影響的實驗研究

劉 賓, 李 菲, 張蔓菁, 夏 煒, 郭樹忠, 魯開化

過氧乙酸對脫細胞血管支架生物學(xué)特性影響的實驗研究

劉 賓, 李 菲, 張蔓菁, 夏 煒, 郭樹忠, 魯開化

目的 探討使用體積分數(shù)為0.1%過氧乙酸處理脫細胞血管支架的生物相容性和生物力學(xué)特征，觀察其作為生物材料消毒劑對于脫細胞血管支架材料生物特性的影響。方法 選取2.0～2.5 kg大耳白兔10只，在無菌條件下切取新鮮的兔股動脈,經(jīng)反復(fù)凍融與超高壓處理后，以15 μg/ml R-Nase A,150 μg/ml D-Nase Ⅰ 核酸酶進行脫細胞處理，室溫下放置于體積分數(shù)為0.1%過氧乙酸溶液中3 h，對其進行組織學(xué)評估，觀察其超微結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)，以及細胞毒性的測定。結(jié)果 經(jīng)體積分數(shù)為0.1%過氧乙酸處理后的脫細胞血管支架，在組織結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)及細胞毒性方面與正常對照組之間無明顯差異。結(jié)論 采用體積分數(shù)為0.1%過氧乙酸處理脫細胞血管支架，對其生物相容性和生物力學(xué)特性無明顯影響，或許可以作為脫細胞組織工程血管生物支架消毒劑的一種選擇。

組織工程血管; 過氧乙酸; 脫細胞血管支架; 消毒

脫細胞血管基質(zhì)因其保留了細胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)和成分,具有低免疫原性、機械性能良好、促進細胞的黏附生長和組織再生的優(yōu)良特性,是一種理想的組織工程血管支架材料,因此,在血管組織工程中得到越來越多的重視和應(yīng)用[1-2]。但是,脫細胞血管支架的研究應(yīng)用,也面臨著傳播供體潛在疾病以及在移植物處理應(yīng)用過程中二次污染的問題。傳統(tǒng)的生物材料滅菌方法存在操作要求條件較高，過程較復(fù)雜,以及可能降低材料的機械強度等缺點[3-5]。因此，我們希望尋找一種操作簡便、滅菌效果確實、費用低廉、殘留低,且對材料性能影響較小的脫細胞血管支架消毒辦法。過氧乙酸(peracetic acid, PAA)是一種強氧化劑，它的自然降解產(chǎn)物無毒或低毒,是其作為滅菌劑的一大優(yōu)點。自2011年9月至2012年6月，我們將體積分數(shù)為0.1%PAA作為脫細胞血管支架的消毒劑，對經(jīng)PAA處理的脫細胞血管支架進行相關(guān)特性的測定，旨在觀察過氧乙酸對脫細胞血管支架材料生物學(xué)特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑來源

選取2.0～2.5 kg大耳白兔10只 (第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心)，核糖核酸酶(R-Nase A)、脫氧核糖核酸酶(D-Nase I)、40%PAA(美國SIGMA公司)。

1.2 方法

1.2.1 脫細胞血管支架的制備 在麻醉及無菌條件下取出兔股動脈(20根)，去除血管外膜后，置入液氮罐中,-196 ℃,1 h,37 ℃水浴復(fù)溫15 min。上述凍融過程反復(fù)進行3次；將反復(fù)凍融的血管材料，以D-Hank液洗凈后放入特制的塑料袋中，袋中浸滿D-Hank液；將塑料袋置入超高壓機器中，5.065×105kPa (4 ℃)處理10 min后，在無菌條件下將內(nèi)層特制塑料袋中的血管取出,并置入含有15 μg/ml R-Nase A,150 μg/ml D-Nase Ⅰ 溶液中，沖洗48 h(37 ℃,5% CO2環(huán)境內(nèi)攪拌)，然后用PBS沖洗1 d[6]。

1.2.2 脫細胞血管支架的PAA處理 將40%PAA溶液,以無菌PBS溶液稀釋成體積分數(shù)為0.1%PAA溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，用滴定法(1N的NaOH)將溶液pH值調(diào)至7.0～7.4；將制備的脫細胞血管支架10根，室溫下放置于體積分數(shù)為0.1%的PAA溶液中3 h;另外10根作為未處理的對照組，同等條件下放置于滅菌PBS溶液中3 h。脫細胞血管材料經(jīng)PAA處理完畢后，在滅菌PBS溶液中沖洗3次，每次30 min。所有材料處理完畢后，無菌保存在-80 ℃冰箱中。

1.2.3 兔血管內(nèi)皮細胞的分離培養(yǎng) 取兔股靜脈>20 cm，6 h內(nèi)進行分離、培養(yǎng),取培養(yǎng)出的5～6代細胞進行試驗。

1.2.4 接觸細胞毒性測定 實驗組：將約3 mm×3 mm 的無菌醫(yī)用粘合膜粘貼于一次性細胞培養(yǎng)皿中央，然后在無菌條件下取5 mm×5 mm大小PAA消毒處理過的脫細胞血管基質(zhì),黏附于細胞培養(yǎng)皿中。對照組：將1滴氰基丙烯酸酯滴加至另一培養(yǎng)皿中央的醫(yī)用粘合膜上；再將準備的內(nèi)皮細胞懸液依次接種于上述培養(yǎng)皿中，于CO2培養(yǎng)箱中(37 ℃,5% CO2)孵育48 h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞與培養(yǎng)皿中央材料毗鄰部位的形態(tài)。1.2.5 材料提取物及不同濃度PAA細胞毒性測定 ⑴取PAA消毒處理的脫細胞血管支架100 mg，用無菌剪刀盡可能地剪碎，將組織碎片放入可密封消毒試管中，稱重，加入DMEM培養(yǎng)液200 ml(2 ml/mg組織)。密封試管于37 ℃孵育96 h，離心4000 r/min, 20 min,取上清液,經(jīng)0.2 μm濾器過濾后測定體積。將提取液與DMEM按照1∶1，1∶4，1∶6,1∶12的體積比稀釋;將0.2%PAA與DMEM按照1∶1，1∶4，1∶6,1∶12的體積比稀釋。然后，將混合溶液分別稀釋為0.1%、0.04%、0.003%、0.0015%,以驗證不同濃度PAA的細胞毒性。⑵用MTT法檢測細胞增殖活性。以上每個試驗濃度設(shè)5個復(fù)孔，并設(shè)定陰性對照孔(DMEM培養(yǎng)液100 μl)和空白孔(無細胞)，進行MTT實驗。每組實驗重復(fù)5次，取平均A值。

1.2.6 經(jīng)PAA處理的脫細胞血管支架材料的膠原含量測定 羥脯氨酸含量測定：經(jīng)PAA處理以及未處理脫細胞基質(zhì)材料各取50 mg，利用Edwards and O′Brien法[7]，測量材料的膠原含量。

1.2.7 處理前后材料機械力學(xué)特性的測定 ⑴最終抗張強度(ultimate tensile strength, UTS )。利用張力實驗機測定經(jīng)PAA處理前后材料的UTS(西安交通大學(xué)工程力學(xué)系機械結(jié)構(gòu)強度與振動，國家重點實驗室MTS-858雙軸液壓生物材料試驗機)。⑵縫線保留測試。利用張力實驗機，完成對經(jīng)PAA處理前后材料的縫線保留測試實驗。

2 結(jié)果

2.1 脫細胞血管基質(zhì)的組織學(xué)觀察

脫細胞血管的管壁纖維波浪狀結(jié)構(gòu)均保存基本完好，支架中完全去除了血管中的細胞成分。

2.2 材料細胞毒性

2.2.1 材料接觸性細胞毒性 經(jīng)過PAA處理的脫細胞血管材料無細胞毒性，在材料周圍的內(nèi)皮細胞形態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞的接觸或者生長抑制。陽性對照組材料周圍的細胞，則出現(xiàn)明顯的生長及接觸抑制，并出現(xiàn)大量的細胞壞死和漂浮(圖1，2)。

2.2.2 材料提取物細胞毒性 ⑴材料提取物的細胞毒性見表1。根據(jù)測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同培養(yǎng)時長內(nèi)，材料提取液不同稀釋比例，各組對于細胞的抑制作用與正常組比較差異，無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。⑵不同稀釋濃度的PAA細胞毒性結(jié)果見表2。根據(jù)測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),濃度低于或等于0.003%的PAA，其細胞的毒性與正常組比較，差異無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 PAA處理后材料與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)(×40) 圖2 帶有氰基丙烯酸酯的粘合膜與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)(×40)

Fig 1 Co-culture of endothelial cells and material treated with PAA vascular (×40). Fig 2 Co-culture of endothelial cells and cyanoacrylates treated with adhesive film (×40).

2.3 材料的膠原含量測定

見表3。

2.4 材料的機械力學(xué)特征

材料的UTS，以及縫線保留測試結(jié)果見表4。

3 討論

作為組織工程血管研究領(lǐng)域的一個熱點，脫細胞血管支架在組織工程血管研究領(lǐng)域，一直有著比較廣泛的應(yīng)用。但是，與其他異體或異種的組織移植物一樣，脫細胞血管支架的研究應(yīng)用也面臨著傳播供體潛在疾病，以及在移植物處理應(yīng)用過程中二次污染的問題。因此，滅菌處理也是高效、快速、安全制備脫細胞組織工程血管支架材料的一個非常重要環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的生物材料滅菌方法主要有以環(huán)氧乙烷為代表的化學(xué)法和以Co60照射為代表的電離輻射法。這兩種通用的滅菌方法有著毋庸質(zhì)疑的滅菌效果，但它們也存在著改變材料生物化學(xué)特性，降低材料生物力學(xué)強度等問題[7]。而能夠達到滅菌效果的足夠劑量的Co60照射處理，明顯降低了生物材料的生物力學(xué)強度。因此，我們設(shè)想能夠找到一種操作簡便，滅菌效果確實，費用低廉，殘留低，且對材料的生物力學(xué)及生物化學(xué)性能影響較小的脫細胞血管支架的消毒辦法。

目前，對于PAA的研究主要集中在其滅菌效能上，而其對材料生物學(xué)特征影響的研究則較少。有研究表明，體積分數(shù)為0.1%PAA是對生物移植物消毒滅菌的最佳濃度[8-9]，而其作為生物材料的消毒劑，則最早應(yīng)用于骨及心臟瓣膜組織[10-12]，以及處理人的脫細胞臏韌帶和測定其對韌帶組織生物相容性及生物力學(xué)特征的影響[13]。結(jié)果表明，經(jīng)PAA處理前后的韌帶組織，其生物學(xué)特性無明顯改變。而PAA對于脫細胞血管基質(zhì)支架的此類管狀生物材料及材料生物力學(xué)和化學(xué)特性影響的研究，國內(nèi)外報道較少。因此，我們的研究中，將可以作為骨骼、瓣膜、韌帶等片狀生物材料消毒劑的PAA，應(yīng)用到脫細胞血管支架的此類管狀生物材料的消毒制備中。在每一種新的生物材料消毒滅菌方法應(yīng)用前，除了其滅菌效能以外，對于生物材料的生物學(xué)特性影響，也是非常重要的考察指標。因為這些生物學(xué)特性對于生物材料日后的應(yīng)用起著非常重要的作用。另外，使用的消毒滅菌試劑在材料的殘留以及是否與材料發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)，亦是重要的考察指標。因此，我們在研究中對體積分數(shù)為0.1%PAA處理的兔脫細胞血管基質(zhì)材料的上述指標進行了體外測試。結(jié)果表明，經(jīng)過體積分數(shù)為0.1%PAA處理的脫細胞血管基質(zhì)，其材料毒性并未明顯增加(接觸以及細胞提取物)；細胞學(xué)實驗表明，與其共培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞增殖旺盛，大量細胞長入材料內(nèi)部。由此看出，經(jīng)過處理后的脫細胞血管基質(zhì)，在體外依然具有良好的生物相容性。

脫細胞血管基質(zhì)的主要成分為膠原纖維，而膠原纖維的主要分解產(chǎn)物為羥脯胺酸。因此，我們通過測定PAA處理前后材料羥脯胺酸的含量，初步判斷體積分數(shù)為0.1%PAA是否與材料發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)。筆者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PAA處理前后的脫細胞血管支架，其羥脯胺酸含量基本一致，從而可以初步表明，PAA未與脫細胞血管基質(zhì)材料發(fā)生明顯的生物化學(xué)反應(yīng)。

表1 不同稀釋濃度材料提取液作用后EC吸光度變化

實驗組培養(yǎng)12h培養(yǎng)24h培養(yǎng)36h原液0.58±0.03*◇0.58±0.01*0.57±0.01*◇1∶40.59±0.01*0.66±0.11*0.70±0.09◇1∶60.61±0.05*◇0.62±0.13*◇0.62±0.07◇1∶80.60±0.03◇0.67±0.090.66±0.14◇M1990.63±0.01*0.64±0.01*0.59±0.05*PBS0.11±0.00*0.11±0.00*0.11±0.00*

注：*同一時段相鄰各濃度組間比較，P>0.05；◇同一濃度不同 時間的組間比較，P>0.05

表2 不同濃度PAA作用后EC吸光度變化

實驗組培養(yǎng)12h培養(yǎng)24h培養(yǎng)36h0.1000%0.06±0.01*0.05±0.02*0.05±0.01*0.0400%0.27±0.01*0.24±0.01*0.19±0.01*0.0030%0.54±0.02*◇0.47±0.01*◇0.56±0.01*◇0.0015%0.59±0.01*◇0.64±0.02*◇0.59±0.01◇M1990.63±0.01*0.64±0.01*0.59±0.05*PBS0.11±0.00*0.11±0.00*0.11±0.00*

注：*濃度≥0.003%PAA同一時段相鄰各濃度組間比較，P<0.05；

◇濃度≤0.003%PAA同一濃度不同時間的組間比較，P>0.05

表3PAA處理前后血管材料的羥脯氨酸含量測定結(jié)果

樣品羥脯氨酸含量(μg/mg)正常血管組2.01±0.16脫細胞血管支架組2.15±0.09過氧乙酸處理脫細胞血管支架組2.13±0.12

注：血管材料的羥脯氨酸含量各組兩兩比較，P>0.05

表4PAA處理后血管材料的生物力學(xué)性能指標測試結(jié)果

樣品最終抗張強度/MPa縫合強度(N/針)正常血管4.51±1.061.58±0.06脫細胞血管支架4.42±1.251.44±0.050.1%PAA處理脫細胞血管支架4.38±1.191.38±0.08

注：血管材料的UTS以及縫合強度各組兩兩比較，P>0.05

足夠的初始強度和彈性，對于組織工程血管支架的材料來說，是非常重要和必需的。因此，我們在研究中測試了經(jīng)PAA處理前后血管組織的強度和彈性，以判斷經(jīng)過體積分數(shù)為0.1%PAA的處理，作為管腔狀脫細胞血管基質(zhì)材料的主要生物力學(xué)指標，是否會發(fā)生明顯的改變;體外測試的結(jié)果(UTS、縫線保留測試)也證實，PAA沒有明顯改變脫細胞血管基質(zhì)的強度和彈性。這一結(jié)果，同時也可以從常規(guī)組織切片的膠原纖維正常形態(tài)中得到證實。

4 結(jié)論

體外試驗初步表明，經(jīng)體積分數(shù)為0.1%PAA處理的脫細胞血管材料，其細胞毒性、生物力學(xué)以及其自身化學(xué)成分，與未經(jīng)PAA處理前比較，差異無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由此我們推斷，應(yīng)用體積分數(shù)為0.1%PAA作為組織工程血管支架制備過程中的消毒滅菌制劑或許是可行的。我們在后續(xù)的動物體內(nèi)試驗中將繼續(xù)驗證這一推論。

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Effects of peracetic acid on the biological features of the acellular vascular scaffold

LIUBin,LIFei,ZHANGMan-jing,etal.

(DepartmentofBurnsandPlasticSurgery,Xi′anCentralHospital,Xi′an710003,China)

Objective To observe the effects of 0.1% volume fraction peracetic acid on the biological features of the acellular vascular scaffold through analyzing the biocompatibility and biomechanics of the acellular vascular scaffold treated by 0.1% volume fraction peracetic acid. Methods Femoral artery were isolated under sterile conditions from 2.0～2.5 kg rabbits (10) and treated by repeated freeze thawing for disruption of donor cells. 15 μg/ml R-Nase A and 150 μg/ml D-Nase Ⅰ concentration of nuclease were used to wash out the cell debris. Then, the scaffold was put into the solution of 0.1% volume fraction peracetic acid for 3 hours at room temperature, the acellular scaffold was evaluated by histological and ultrastructural observation, the biomechanics and cytotoxicity of the blood vessels that treated by repeated freeze thawing and ultrahigh pressure was also evaluated. Results From the histological and ultrastructural analysis, the acellular scaffold treated by 0.1% volume fraction peracetic acid has no obvious difference in tissue construction, biomechanics and cytotoxicity compared with the normal control group. Conclusion This tissue processing of disinfection by 0.1% volume fraction peracetic acid treatment has not obvious effect on the biocmpatibility and biomechanics of the acellular scaffold, and it may be a alternative of disinfector for the acellular bioscaffold preparation.

Tissue engineering blood vessels; Peracetic acid; Acellular vascular scaffold; Disinfection

710003 陜西 西安，西安市中心醫(yī)院 燒傷整形外科(劉 賓);西安醫(yī)學(xué)院護理學(xué)院(李 菲)；昆明醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院(張蔓菁)；第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 整形外科(夏 煒,郭樹忠,魯開化) 第一作者：劉 賓(1978-),男，陜西西安人，副主任醫(yī)師，副教授,碩士生導(dǎo)師,博士. 通信作者：魯開化,710003,第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 整形外科, 電子信箱:lukaihua@fmmu.edu.cn

實驗研究

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.09.020

R318

A

1673-7040(2015)09-0567-04

2015-04-23)