疏水性Fe3O4磁性納米粒子的表面改性修飾

解矛盾 閆 瑾（德州學(xué)院醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院，山東 德州 253023）

疏水性Fe3O4磁性納米粒子的表面改性修飾

解矛盾 閆 瑾
（德州學(xué)院醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院，山東 德州 253023）

通過(guò)在 Fe3O4磁性納米粒子表面包覆一些生物分子（如：多巴胺、RGD環(huán)肽等）來(lái)改變粒子表面的性質(zhì)，制得了一系列復(fù)合磁性納米粒子。在原有的疏水性Fe3O4磁性納米粒子（MNPs）表面包覆多巴胺（Dopamine，DA），利用多巴胺的鄰苯二酚羥基和氨基基團(tuán)可通過(guò)共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵等形式鍵合在一起的性質(zhì)使其表面氨基化，產(chǎn)物與水的接觸角的測(cè)試結(jié)果表明，粒子由疏水性的MNPs轉(zhuǎn)變?yōu)榱擞H水性的DA-MNPs，實(shí)現(xiàn)了MNPs表面的改性修飾。將DA-MNP用c（RGDyk）肽包覆，最終可得到能與腫瘤細(xì)胞整合素相結(jié)合的，可實(shí)現(xiàn)磁性納米粒子的靶向給藥作用的RGD-DA-MNPs。

RGD環(huán)肽；多巴胺；疏水性；氨基化；靶向

隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展，有關(guān) Fe3O4性質(zhì)的研究越來(lái)越受到重視。磁性納米Fe3O4由于磁性吸引和范德華力的協(xié)同作用使其易于團(tuán)聚，且由于其表面的官能團(tuán)很少，所以應(yīng)用范圍有限。為了有效地穩(wěn)定Fe3O4粒子，同時(shí)也為了更多的引入特殊官能團(tuán)，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，通常要在其表面引入其他分子作為穩(wěn)定劑對(duì)其進(jìn)行修飾［1-4］。多巴胺含有鄰苯二酚羥基和氨基基團(tuán)，研究表明，鄰苯二酚羥基和氨基都有很高的活性，能與各種材料以共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的形式形成很強(qiáng)的作用力。在有氧潮濕的條件下，多巴胺易發(fā)生自聚合反應(yīng)形成具有很強(qiáng)親水性的聚多巴胺，含有的鄰苯二酚和氨基基團(tuán)可以和羥基、氨基、硫醇、羧基和酯基等官能團(tuán)發(fā)生接枝反應(yīng)［5-8］。自1984年P(guān)ierschbacher和Ruosluherici首次報(bào)道纖維蛋白原中含有的RGD序列可作為細(xì)胞的識(shí)別位點(diǎn)以來(lái)，RGD肽即作為潛在的示蹤劑成為研究熱點(diǎn)。RGD肽是一類(lèi)含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）的環(huán)肽，是整合素 αvβ3的受體拮抗多肽。研究表明，整合素 αvβ3通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移及調(diào)往等功能抑制腫瘤血管的生成。外源性RGD肽與腫瘤細(xì)胞表面整合素結(jié)合后，可從多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用［9-13］。

南昌博士王進(jìn)華等人［1］曾將人血清白蛋白和多巴胺用于修飾 Fe3O4納米粒子，但人血清白蛋白原料昂貴，成本較高；喬瑞瑞等［14］將 RGD修飾到四氧化三鐵上，但其制備方法太繁雜，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本文先將多巴胺有效修飾到Fe3O4上，使多巴胺上的兩個(gè)羥基與Fe結(jié)合，生成兩個(gè)Fe-O鍵，達(dá)到多巴胺修飾的效果，然后再根據(jù)曼尼希反應(yīng)將C（RGDYK）肽結(jié)合到多巴胺-Fe3O4粒子上，成本低廉，操作簡(jiǎn)單。具體反應(yīng)如圖1所示。

圖1 曼尼希反應(yīng)原理圖

1.實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

Fe3O4（阿拉丁試劑 99%），上海晶純?cè)噭┯邢薰?；c（RGDyk）（95%），上海強(qiáng)耀生物技術(shù)有限公司；HCl（分析純），煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；甲醛（分析純）萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；二甲基甲酰胺（DMF，99.5%），二甲基亞砜（DMSO，99%），天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 DA對(duì)MNPs的表面改性修飾

Fe3O4相互之間由于磁性吸引和范德華力作用易產(chǎn)生聚沉現(xiàn)象，故先將油性MNPs于氯仿內(nèi)超聲分散4-5 min，測(cè)其粒徑、電位及接觸角。為了探尋多巴胺與Fe3O4納米粒子結(jié)合的最佳比例，我們做了四組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分別探討，其中，MNPs與 DA質(zhì)量比分別為 5:2、5:1、10: 1、20:1。取一定質(zhì)量的 DA分別溶解在DMSO中并加入到油性MNPs的氯仿溶液內(nèi)，通過(guò)機(jī)械攪拌形成均質(zhì)溶液，均勻加熱至 70℃水浴恒溫振蕩 1h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，得DA-MNPs粒子。過(guò)濾洗滌后測(cè)其粒徑及電位并比較，得最佳實(shí)驗(yàn)條件為 m（MNPs）:m（DA）=5:1組，并將該組用于后續(xù)研究。

取上述溶液，以正己烷:DA-MNPs溶液體積比為 1: 1的比例混合，以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心 15min后收集DA-MNPs，用真空干燥箱干燥，得粉狀 DA-MNPs納米磁性粒子，測(cè)定與水的接觸角，將其質(zhì)量濃度稀釋至1‰左右，測(cè)其粒徑及zeta電位。

1.3 RGD肽對(duì)DA-MNPs的表面改性修飾

將6mgDA-MNPs粉末用2ml二甲基甲酰胺溶解，按順序依次加入1ml的 RGD（M.W.=619.7，2mg/ml）溶液，200μl的甲醛溶液（37%）和100μl 1M HCl溶液，室溫下攪拌反應(yīng)3h。將產(chǎn)物用離心機(jī)在9000r/min條件下離心30min，倒出上清液，用蒸餾水洗滌3次以回收底部的粒子，得RGD-DA-MNPs，用聲波降解法將粒子均勻分散于2ml的去離子水中，取出部分進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)其粒徑及電位，烘干，測(cè)其紅外光譜。

1.4 產(chǎn)物的表征

使用英國(guó)Malvern公司的Nano-ZS納米粒徑儀測(cè)定各種反應(yīng)前后物質(zhì)的粒徑并使用 zeta電位儀測(cè)定各種反應(yīng)后物質(zhì)穩(wěn)定性變化；使用昆山市超聲儀器有限公司的KQ-200 VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器對(duì)粒子進(jìn)行超聲分散處理；包裹DA并離心后，使用上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司的真空干燥箱通過(guò)測(cè)定上清液中DA的含量來(lái)測(cè)定DA-MNPs的多巴胺包覆率；使用東莞市晟鼎精密儀器有限公司的自動(dòng)型接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定粒子與水接觸角；使用德國(guó) Bruber公司的的傅里葉變換紅外光譜測(cè)試儀測(cè)定對(duì)MNPs進(jìn)行不同程度的修飾后的紅外光譜圖，并通過(guò)比較光譜圖中吸收峰位置的變化來(lái)探討RGD肽是否接枝成功。

2.結(jié)果與討論

2.1 粒徑電位的比較

為了探討經(jīng)不同程度修飾后粒子的穩(wěn)定性，將溶液稀釋至1/1000濃度，放于超聲儀中超聲 5min，使形成均質(zhì)溶液，放入馬爾文Zetasizer Nano ZS儀器測(cè)量?jī)x的樣品池中進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試溫度為25℃，入射激光波長(zhǎng)為633nm，其偏振光與散射光檢測(cè)平面垂直，測(cè)定各步經(jīng)修飾前后的 Fe3O4磁性納米粒子的平均粒徑和粒徑分布。結(jié)果如圖2-3。

圖2 從左到右依次是MNPs、DA-MNPs、RGD-DA-MNPs的粒徑圖

圖3 從左到右依次是MNPs、DA-MNPs、RGD-DA-MNPs的電位圖

如圖2、圖3所示，MNPs、DA-MNPs、RGD-DAMNPs的粒徑值分別為為 87、245.9、471.5nm；電位絕對(duì)值大小分別是0、21.6、25.8 mV。

由圖2可見(jiàn)，MNPs、DA-MNPs、RGD-DA-MNPs的粒徑明顯增大。雖然分散系數(shù)與粒徑大小略有增大，粒徑分布圖仍然尖銳，但粒子分布比較集中，顆粒大小也比較均勻。接枝RGD后分散系數(shù)增大，粒徑略有增大，但平均值均控制在470nm左右。

一般來(lái)說(shuō)，顆粒表面電位愈高，顆粒的分散體系愈穩(wěn)定。水相中顆粒分散穩(wěn)定性的分界線一般認(rèn)為在+ 30mV或-30mV處，如果所有顆粒均帶有高于+30mV或低于-30mV的zeta電位，則該分散體系就比較穩(wěn)定。粒子在水溶液中的分散性主要取決于顆粒表面的 zeta電位，當(dāng)磁性納米粒子表面電荷足夠大從而能夠在粒子間產(chǎn)生足夠強(qiáng)的靜電排斥力時(shí)，靜電排斥力足以對(duì)抗納米粒子之間的團(tuán)聚，磁性納米粒子則能夠成為穩(wěn)定的分散體系。

由圖3可見(jiàn)，未經(jīng)修飾的Fe3O4的zeta電位為 0或近于0，此時(shí)的磁性粒子傾向于快速凝結(jié)或凝聚。將其超聲分散后，再用多巴胺對(duì)其包覆，所得磁性粒子的電位絕對(duì)值雖未超過(guò)30mV，但較修飾前的電位明顯升高，一定程度上提高了磁粒的分散性，zeta電位的分析結(jié)果有力地證明了多巴胺成功包覆在Fe3O4磁性納米粒子表面。當(dāng)RGD成功接枝到粒子表面后，電位值由正變?yōu)樨?fù)，且絕對(duì)值進(jìn)一步升高，不但證明成功接枝了RGD，且接枝RGD后的分散體系更加趨于穩(wěn)定。

2.2 紅外光譜圖的比較

本實(shí)驗(yàn)采用磁力吸附洗滌和真空干燥法對(duì)DAMNPs、RGD-DAMNPs進(jìn)行純化后，分別對(duì)接枝RGD前的DA-MNPs和接枝RGD后的RGDDA-MNPs進(jìn)行傅立葉紅外光譜分析，將掃描范圍設(shè)置為4000～0cm-1，掃描次數(shù)16次得圖4。

圖4 MNPs、DA-MNPs、RGD-DA-MNPs的紅外光譜圖

如圖4所示，在波長(zhǎng)為550cm 左右處有Fe-O鍵的吸收峰，當(dāng)粒子尺寸減小到納米級(jí)，會(huì)引起粒子表面鍵力常數(shù)增大，大量原子暴露在外面，非局域電子發(fā)生重排，因此粒子的紅外光譜會(huì)左移，從而使本來(lái)580cm-1處的吸收峰會(huì)移動(dòng)到波數(shù)550cm-1左右。

DA-MNPs和接枝RGD后的RGD-DA-MNPs除了在3500～3300cm-1處有-NH2的中等吸收峰外，在3000～2800cm-1還有飽和-C-H鍵的特征吸收峰，但MNPs在代表多巴胺的-NH2基的 3500～33000cm-1以及代表-CH鍵3000～2800cm-1處均未有吸收峰出現(xiàn)。因此可以判斷多巴胺已成功包覆多巴胺。MNPs、DA-MNPs、RGDDA-MNPs在 1600cm-1處均存在-C=O基團(tuán)的吸收峰，比較MNPs及RGD-DA-MNPs譜線可見(jiàn)，RGD-DAMNPs峰高高于MNPs，因此RGD-DA-MNPs所含-C=O基團(tuán)的數(shù)目高于MNPs，可得出RGD已成功接枝到粒子表面。

2.3 包裹DA前后接觸角的變化

圖5 MNPs（左）與DA-MNPs（右）與水接觸角的變化圖

表面張力是固體表面重要的物理化學(xué)參數(shù)之一，其大小與相接觸面的兩相物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。表面張力與接觸角呈反比。用自動(dòng)型接觸角測(cè)定儀分別測(cè)定MNPs 和DA-MNPs與水的接觸角，結(jié)果如圖5所示，MNPs及DA-MNPs的角度分別為127.97°、56.48°。疏水性Fe3O4的表面張力較小，與水接觸角比較大，包覆DA后，表面張力增加，其表面能升高，故水在DA-MNPs上的接觸角就會(huì)由127.97°變?yōu)?6.48°，潤(rùn)濕性變好。

2.4 測(cè)RGD的接枝率

RGD最有特征性的吸收波長(zhǎng)是肽鍵，為 214nm。因此，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)試溶液中肽的含量是計(jì)算RGD接枝率的最佳方法。首先配制一系列的RGD的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在214nm的波長(zhǎng)下對(duì)其進(jìn)行紫外測(cè)試，并繪制曲線如下圖。

取100mgRGD與相對(duì)應(yīng)量的DA-MNPs根據(jù)接枝RGD的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行反應(yīng)，得到 13ml的 RGD-DAMNPs，洗滌數(shù)次至無(wú)游離RGD并制成13ml溶液。取上述溶液2ml稀釋到6ml作為樣品測(cè)得其在波長(zhǎng)為214nm的紫外吸光度為 1.644，相對(duì)應(yīng)的 RGD濃度為1.65。則RGD的接枝率￡可以表示為

￡=1.65×6÷2×13÷100×100%=64.35%

因此可得RGD的接枝率為64.35%。

［1］代明珠，李俊，康斌，任超，戴耀東，董宇.四氧化三鐵/碳納米管復(fù)合材料的制備及對(duì)放射性廢水中銅離子的吸附［J］.材料導(dǎo)報(bào) B（研究篇），2013，27（5）:83-86.

［2］周蒞霖，況錦銘，袁金穎.四氧化三鐵納米粒子表面接枝聚合制備磁性聚合物微球 ［J］.化學(xué)進(jìn)展，2009，21（9）:1880-1887.

［3］王偉，吳堯，顧忠偉.磁性納米粒子的表面改性及其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.中國(guó)材料進(jìn)展，2009，28（1）:43-48.

［4］李紹霞.磁性納米粒子的表面功能化修飾［D］.煙臺(tái)：煙臺(tái)大學(xué)，2009.

［5］許春花.多巴胺表面修飾制備SiO2-Ag纖維復(fù)合材料的研究［D］.北京：北京化工大學(xué)，2012.

［6］徐又一，等.多巴胺的自聚-附著行為與膜表面功能化［J］.膜科學(xué)與技術(shù)，2011，31（3）:32-38.

［7］王進(jìn)華.HSA-Dopamine-Fe3O4納米顆粒的磁特性及相關(guān)分子影像學(xué)的實(shí)驗(yàn)研究［D］.南昌：南昌大學(xué)，2009.

［8］朱麗君，王文才.多巴胺對(duì)炭黑/CNTs表面功能化修飾的研究［D］.北京：北京化工大學(xué)，2012.

［9］陳中亞，趙雁，陶濤.RGD肽介導(dǎo)的腦膠質(zhì)瘤靶向治療和顯像的研究進(jìn)展 ［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44（3）:290-295.

［10］張麗，張春麗，王榮福.RGD肽類(lèi)腫瘤靶向受體顯像的研究現(xiàn)狀及前景［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2010，26（6）:1176-1178.

［11］安蓮效，李慧，顧月清.RGD肽作為藥物靶向配體的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)生化藥物雜志，2010，31（1）:66-69.

［12］Jin Xie，Kai Chen，Ha-Young Lee，Chenjie Xu，Andrew R. Hsu，Sheng Peng，Xiaoyuan Chen，Shouheng Sun.Ultrasmall c （RGDyK）-Coated Fe3O4 Nanoparticles and Their Specific Targeting to Integrin rv3-Rich Tumor Cells，J.AM.CHEM. SOC.2008，130，7542-7543.

［13］曹馨，于衛(wèi)強(qiáng)，張富強(qiáng).RGD肽修飾TiO2納米管對(duì)成骨細(xì)胞黏附的影響［R］.口腔醫(yī)學(xué)研究，2012:522-530.

［14］喬瑞瑞，賈巧娟，曾劍峰，高明遠(yuǎn).磁性氧化鐵納米顆粒及其磁共振成像應(yīng)用 ［J］.生物物理學(xué)報(bào)，2011，27（4）:272-288.

（責(zé)任編輯 張 蓓）

O61

A

1008-7257（2015）04-0077-03

2015-03-31

解矛盾（1992-），女，山東東平人，德州學(xué)院制藥工程專(zhuān)業(yè)，研究方向：腫瘤分子靶向。