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    疏水性Fe3O4磁性納米粒子的表面改性修飾

    2015-09-02 01:53:21解矛盾德州學(xué)院醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院山東德州253023
    焦作大學(xué)學(xué)報(bào) 2015年4期
    關(guān)鍵詞:接枝磁性多巴胺

    解矛盾 閆 瑾(德州學(xué)院醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院,山東 德州 253023)

    疏水性Fe3O4磁性納米粒子的表面改性修飾

    解矛盾 閆 瑾
    (德州學(xué)院醫(yī)藥與護(hù)理學(xué)院,山東 德州 253023)

    通過(guò)在 Fe3O4磁性納米粒子表面包覆一些生物分子(如:多巴胺、RGD環(huán)肽等)來(lái)改變粒子表面的性質(zhì),制得了一系列復(fù)合磁性納米粒子。在原有的疏水性Fe3O4磁性納米粒子(MNPs)表面包覆多巴胺(Dopamine,DA),利用多巴胺的鄰苯二酚羥基和氨基基團(tuán)可通過(guò)共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵等形式鍵合在一起的性質(zhì)使其表面氨基化,產(chǎn)物與水的接觸角的測(cè)試結(jié)果表明,粒子由疏水性的MNPs轉(zhuǎn)變?yōu)榱擞H水性的DA-MNPs,實(shí)現(xiàn)了MNPs表面的改性修飾。將DA-MNP用c(RGDyk)肽包覆,最終可得到能與腫瘤細(xì)胞整合素相結(jié)合的,可實(shí)現(xiàn)磁性納米粒子的靶向給藥作用的RGD-DA-MNPs。

    RGD環(huán)肽;多巴胺;疏水性;氨基化;靶向

    隨著納米技術(shù)的飛速發(fā)展,有關(guān) Fe3O4性質(zhì)的研究越來(lái)越受到重視。磁性納米Fe3O4由于磁性吸引和范德華力的協(xié)同作用使其易于團(tuán)聚,且由于其表面的官能團(tuán)很少,所以應(yīng)用范圍有限。為了有效地穩(wěn)定Fe3O4粒子,同時(shí)也為了更多的引入特殊官能團(tuán),擴(kuò)大其應(yīng)用范圍,通常要在其表面引入其他分子作為穩(wěn)定劑對(duì)其進(jìn)行修飾[1-4]。多巴胺含有鄰苯二酚羥基和氨基基團(tuán),研究表明,鄰苯二酚羥基和氨基都有很高的活性,能與各種材料以共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的形式形成很強(qiáng)的作用力。在有氧潮濕的條件下,多巴胺易發(fā)生自聚合反應(yīng)形成具有很強(qiáng)親水性的聚多巴胺,含有的鄰苯二酚和氨基基團(tuán)可以和羥基、氨基、硫醇、羧基和酯基等官能團(tuán)發(fā)生接枝反應(yīng)[5-8]。自1984年P(guān)ierschbacher和Ruosluherici首次報(bào)道纖維蛋白原中含有的RGD序列可作為細(xì)胞的識(shí)別位點(diǎn)以來(lái),RGD肽即作為潛在的示蹤劑成為研究熱點(diǎn)。RGD肽是一類(lèi)含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)的環(huán)肽,是整合素 αvβ3的受體拮抗多肽。研究表明,整合素 αvβ3通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移及調(diào)往等功能抑制腫瘤血管的生成。外源性RGD肽與腫瘤細(xì)胞表面整合素結(jié)合后,可從多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用[9-13]。

    南昌博士王進(jìn)華等人[1]曾將人血清白蛋白和多巴胺用于修飾 Fe3O4納米粒子,但人血清白蛋白原料昂貴,成本較高;喬瑞瑞等[14]將 RGD修飾到四氧化三鐵上,但其制備方法太繁雜,不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本文先將多巴胺有效修飾到Fe3O4上,使多巴胺上的兩個(gè)羥基與Fe結(jié)合,生成兩個(gè)Fe-O鍵,達(dá)到多巴胺修飾的效果,然后再根據(jù)曼尼希反應(yīng)將C(RGDYK)肽結(jié)合到多巴胺-Fe3O4粒子上,成本低廉,操作簡(jiǎn)單。具體反應(yīng)如圖1所示。

    圖1 曼尼希反應(yīng)原理圖

    1.實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 試劑

    Fe3O4(阿拉丁試劑 99%),上海晶純?cè)噭┯邢薰?;c(RGDyk)(95%),上海強(qiáng)耀生物技術(shù)有限公司;HCl(分析純),煙臺(tái)市雙雙化工有限公司;甲醛(分析純)萊陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠;二甲基甲酰胺(DMF,99.5%),二甲基亞砜(DMSO,99%),天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

    1.2 DA對(duì)MNPs的表面改性修飾

    Fe3O4相互之間由于磁性吸引和范德華力作用易產(chǎn)生聚沉現(xiàn)象,故先將油性MNPs于氯仿內(nèi)超聲分散4-5 min,測(cè)其粒徑、電位及接觸角。為了探尋多巴胺與Fe3O4納米粒子結(jié)合的最佳比例,我們做了四組實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分別探討,其中,MNPs與 DA質(zhì)量比分別為 5:2、5:1、10: 1、20:1。取一定質(zhì)量的 DA分別溶解在DMSO中并加入到油性MNPs的氯仿溶液內(nèi),通過(guò)機(jī)械攪拌形成均質(zhì)溶液,均勻加熱至 70℃水浴恒溫振蕩 1h,反應(yīng)結(jié)束后,冷卻至室溫,得DA-MNPs粒子。過(guò)濾洗滌后測(cè)其粒徑及電位并比較,得最佳實(shí)驗(yàn)條件為 m(MNPs):m(DA)=5:1組,并將該組用于后續(xù)研究。

    取上述溶液,以正己烷:DA-MNPs溶液體積比為 1: 1的比例混合,以12000r/min的轉(zhuǎn)速離心 15min后收集DA-MNPs,用真空干燥箱干燥,得粉狀 DA-MNPs納米磁性粒子,測(cè)定與水的接觸角,將其質(zhì)量濃度稀釋至1‰左右,測(cè)其粒徑及zeta電位。

    1.3 RGD肽對(duì)DA-MNPs的表面改性修飾

    將6mgDA-MNPs粉末用2ml二甲基甲酰胺溶解,按順序依次加入1ml的 RGD(M.W.=619.7,2mg/ml)溶液,200μl的甲醛溶液(37%)和100μl 1M HCl溶液,室溫下攪拌反應(yīng)3h。將產(chǎn)物用離心機(jī)在9000r/min條件下離心30min,倒出上清液,用蒸餾水洗滌3次以回收底部的粒子,得RGD-DA-MNPs,用聲波降解法將粒子均勻分散于2ml的去離子水中,取出部分進(jìn)行檢測(cè),測(cè)其粒徑及電位,烘干,測(cè)其紅外光譜。

    1.4 產(chǎn)物的表征

    使用英國(guó)Malvern公司的Nano-ZS納米粒徑儀測(cè)定各種反應(yīng)前后物質(zhì)的粒徑并使用 zeta電位儀測(cè)定各種反應(yīng)后物質(zhì)穩(wěn)定性變化;使用昆山市超聲儀器有限公司的KQ-200 VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器對(duì)粒子進(jìn)行超聲分散處理;包裹DA并離心后,使用上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司的真空干燥箱通過(guò)測(cè)定上清液中DA的含量來(lái)測(cè)定DA-MNPs的多巴胺包覆率;使用東莞市晟鼎精密儀器有限公司的自動(dòng)型接觸角測(cè)量?jī)x測(cè)定粒子與水接觸角;使用德國(guó) Bruber公司的的傅里葉變換紅外光譜測(cè)試儀測(cè)定對(duì)MNPs進(jìn)行不同程度的修飾后的紅外光譜圖,并通過(guò)比較光譜圖中吸收峰位置的變化來(lái)探討RGD肽是否接枝成功。

    2.結(jié)果與討論

    2.1 粒徑電位的比較

    為了探討經(jīng)不同程度修飾后粒子的穩(wěn)定性,將溶液稀釋至1/1000濃度,放于超聲儀中超聲 5min,使形成均質(zhì)溶液,放入馬爾文Zetasizer Nano ZS儀器測(cè)量?jī)x的樣品池中進(jìn)行測(cè)試,測(cè)試溫度為25℃,入射激光波長(zhǎng)為633nm,其偏振光與散射光檢測(cè)平面垂直,測(cè)定各步經(jīng)修飾前后的 Fe3O4磁性納米粒子的平均粒徑和粒徑分布。結(jié)果如圖2-3。

    圖2 從左到右依次是MNPs、DA-MNPs、RGD-DA-MNPs的粒徑圖

    圖3 從左到右依次是MNPs、DA-MNPs、RGD-DA-MNPs的電位圖

    如圖2、圖3所示,MNPs、DA-MNPs、RGD-DAMNPs的粒徑值分別為為 87、245.9、471.5nm;電位絕對(duì)值大小分別是0、21.6、25.8 mV。

    由圖2可見(jiàn),MNPs、DA-MNPs、RGD-DA-MNPs的粒徑明顯增大。雖然分散系數(shù)與粒徑大小略有增大,粒徑分布圖仍然尖銳,但粒子分布比較集中,顆粒大小也比較均勻。接枝RGD后分散系數(shù)增大,粒徑略有增大,但平均值均控制在470nm左右。

    一般來(lái)說(shuō),顆粒表面電位愈高,顆粒的分散體系愈穩(wěn)定。水相中顆粒分散穩(wěn)定性的分界線一般認(rèn)為在+ 30mV或-30mV處,如果所有顆粒均帶有高于+30mV或低于-30mV的zeta電位,則該分散體系就比較穩(wěn)定。粒子在水溶液中的分散性主要取決于顆粒表面的 zeta電位,當(dāng)磁性納米粒子表面電荷足夠大從而能夠在粒子間產(chǎn)生足夠強(qiáng)的靜電排斥力時(shí),靜電排斥力足以對(duì)抗納米粒子之間的團(tuán)聚,磁性納米粒子則能夠成為穩(wěn)定的分散體系。

    由圖3可見(jiàn),未經(jīng)修飾的Fe3O4的zeta電位為 0或近于0,此時(shí)的磁性粒子傾向于快速凝結(jié)或凝聚。將其超聲分散后,再用多巴胺對(duì)其包覆,所得磁性粒子的電位絕對(duì)值雖未超過(guò)30mV,但較修飾前的電位明顯升高,一定程度上提高了磁粒的分散性,zeta電位的分析結(jié)果有力地證明了多巴胺成功包覆在Fe3O4磁性納米粒子表面。當(dāng)RGD成功接枝到粒子表面后,電位值由正變?yōu)樨?fù),且絕對(duì)值進(jìn)一步升高,不但證明成功接枝了RGD,且接枝RGD后的分散體系更加趨于穩(wěn)定。

    2.2 紅外光譜圖的比較

    本實(shí)驗(yàn)采用磁力吸附洗滌和真空干燥法對(duì)DAMNPs、RGD-DAMNPs進(jìn)行純化后,分別對(duì)接枝RGD前的DA-MNPs和接枝RGD后的RGDDA-MNPs進(jìn)行傅立葉紅外光譜分析,將掃描范圍設(shè)置為4000~0cm-1,掃描次數(shù)16次得圖4。

    圖4 MNPs、DA-MNPs、RGD-DA-MNPs的紅外光譜圖

    如圖4所示,在波長(zhǎng)為550cm 左右處有Fe-O鍵的吸收峰,當(dāng)粒子尺寸減小到納米級(jí),會(huì)引起粒子表面鍵力常數(shù)增大,大量原子暴露在外面,非局域電子發(fā)生重排,因此粒子的紅外光譜會(huì)左移,從而使本來(lái)580cm-1處的吸收峰會(huì)移動(dòng)到波數(shù)550cm-1左右。

    DA-MNPs和接枝RGD后的RGD-DA-MNPs除了在3500~3300cm-1處有-NH2的中等吸收峰外,在3000~2800cm-1還有飽和-C-H鍵的特征吸收峰,但MNPs在代表多巴胺的-NH2基的 3500~33000cm-1以及代表-CH鍵3000~2800cm-1處均未有吸收峰出現(xiàn)。因此可以判斷多巴胺已成功包覆多巴胺。MNPs、DA-MNPs、RGDDA-MNPs在 1600cm-1處均存在-C=O基團(tuán)的吸收峰,比較MNPs及RGD-DA-MNPs譜線可見(jiàn),RGD-DAMNPs峰高高于MNPs,因此RGD-DA-MNPs所含-C=O基團(tuán)的數(shù)目高于MNPs,可得出RGD已成功接枝到粒子表面。

    2.3 包裹DA前后接觸角的變化

    圖5 MNPs(左)與DA-MNPs(右)與水接觸角的變化圖

    表面張力是固體表面重要的物理化學(xué)參數(shù)之一,其大小與相接觸面的兩相物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。表面張力與接觸角呈反比。用自動(dòng)型接觸角測(cè)定儀分別測(cè)定MNPs 和DA-MNPs與水的接觸角,結(jié)果如圖5所示,MNPs及DA-MNPs的角度分別為127.97°、56.48°。疏水性Fe3O4的表面張力較小,與水接觸角比較大,包覆DA后,表面張力增加,其表面能升高,故水在DA-MNPs上的接觸角就會(huì)由127.97°變?yōu)?6.48°,潤(rùn)濕性變好。

    2.4 測(cè)RGD的接枝率

    RGD最有特征性的吸收波長(zhǎng)是肽鍵,為 214nm。因此,通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)試溶液中肽的含量是計(jì)算RGD接枝率的最佳方法。首先配制一系列的RGD的標(biāo)準(zhǔn)溶液,在214nm的波長(zhǎng)下對(duì)其進(jìn)行紫外測(cè)試,并繪制曲線如下圖。

    取100mgRGD與相對(duì)應(yīng)量的DA-MNPs根據(jù)接枝RGD的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行反應(yīng),得到 13ml的 RGD-DAMNPs,洗滌數(shù)次至無(wú)游離RGD并制成13ml溶液。取上述溶液2ml稀釋到6ml作為樣品測(cè)得其在波長(zhǎng)為214nm的紫外吸光度為 1.644,相對(duì)應(yīng)的 RGD濃度為1.65。則RGD的接枝率£可以表示為

    £=1.65×6÷2×13÷100×100%=64.35%

    因此可得RGD的接枝率為64.35%。

    [1]代明珠,李俊,康斌,任超,戴耀東,董宇.四氧化三鐵/碳納米管復(fù)合材料的制備及對(duì)放射性廢水中銅離子的吸附[J].材料導(dǎo)報(bào) B(研究篇),2013,27(5):83-86.

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    (責(zé)任編輯 張 蓓)

    O61

    A

    1008-7257(2015)04-0077-03

    2015-03-31

    解矛盾(1992-),女,山東東平人,德州學(xué)院制藥工程專(zhuān)業(yè),研究方向:腫瘤分子靶向。

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