軟絲藻多糖的提取及理化性質(zhì)分析

張澤峰，王晨旭，裴　蕊，祝肖梅，黃笑悅，陳　蔭（浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山　316022）

軟絲藻多糖的提取及理化性質(zhì)分析

張澤峰，王晨旭，裴蕊，祝肖梅，黃笑悅，陳蔭
（浙江海洋學(xué)院食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山316022）

采用熱水提取的方法從舟山海域中的軟絲藻中提取多糖成分，得率為25%。并對其多糖進(jìn)行理化性質(zhì)研究。研究結(jié)果表明，軟絲藻多糖是硫酸酯化的酸性多糖，其硫酸基含量為26%，糖醛酸含量為23%，單糖組成及比率為Man：Rha：GlcUA：Glc：Xyl：Arb=2.7：5.5：5.0：3.2：1.4：1.0，分子量主要分布在210 kDa和10 kDa左右。

軟絲藻；多糖；理化性質(zhì)

軟絲藻Ulothrix flacca Dillwyn.Thuret.，隸綠藻門Chlorophyta絲藻目Ulotrichales絲藻科Ulotrichaceae。分布于遼寧、山東、浙江、福建、廣東等地沿海，生中、高潮帶巖石上，盛期12月-翌年3月。浙江沿海主要分布海礁、嵊山、普陀山、漁山、南麂等地。藻體性寒，味咸；有清熱解毒，利水滲濕，軟堅(jiān)散結(jié)之效，民間多有食用習(xí)慣［1］。綠藻為藻類中第一大門類，資源豐富，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，但是相比褐藻和紅藻來說，開發(fā)利用仍相對滯后。研究表明，綠藻富含多種活性成分，特別是綠藻中的多糖具有抗輻射、抗凝血和抗病毒等多種生物活性［2-5］。本研究首次以舟山海域的軟絲藻為研究對象，對其中多糖的含量及理化性質(zhì)進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開發(fā)海洋綠藻糖類資源，促進(jìn)軟絲藻的利用提供基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

軟絲藻藻體采自浙江舟山東極島；甘露糖（Man）、氨基葡萄糖（GlcN）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（GaD）、木糖（Xy1）、阿拉伯糖（Ara）和巖藻糖（Fuc）標(biāo)準(zhǔn)品及胎牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為美國Sigma公司產(chǎn)品；高聚葡聚糖分子量標(biāo)準(zhǔn)品（P82）以及Shodex Ohpak SB-804HQ（8.0 mm× 300 mm）凝膠色譜柱為日本Shodex公司產(chǎn)品；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。高效液相色譜儀（LC-20AD，日本島津公司）；紫外檢測器（SPD-20A Shimadzu公司）；紫外可見分光光度計(jì)。

1.2方法

1.2.1軟絲藻多糖的提取

采用熱水提取的方法從軟絲藻中提取多糖［6］。首先軟絲藻藻體經(jīng)過清洗烘干粉碎后過40目篩，經(jīng)丙酮脫脂后40℃干燥。取一定量脫脂藻粉加20倍水（質(zhì)量體積比），于100℃攪拌提取4 h后離心取上清液，重復(fù)提取3次后合并上清液，將上清液減壓濃縮后加入4倍體積乙醇進(jìn)行沉淀。靜置過夜，離心收集沉淀。沉淀用水溶解，使用Sevag法除蛋白后透析除鹽（截留分子量3500透析袋），濃度后冷凍干燥，得軟絲藻多糖。

1.2.2軟絲藻多糖的分子量分析

采用高效凝膠滲透色譜法分析軟絲藻多糖的分子量范圍［7］，色譜條件：色譜柱：Shodex Ohpak SB-806HQ凝膠色譜柱（300 mm×8.0 mm）；柱溫：35℃；流動(dòng)相：0.1 mol/L的Na2SO4；流速：0.5 mL/min；檢測器：示差檢測器（RID）。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：已知分子量的系列標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（2.5×103、6.1×103、9.6×103、21×103、22.8×103和47.1× 103u）。加流動(dòng)相溶解，制成5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。運(yùn)用GPC分析軟件以標(biāo)準(zhǔn)多糖分子量的對數(shù)（logMw）對保留時(shí)間（tR）作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3硫酸基含量的測定［8］

樣品完全酸水解后，采用離子色譜法測定多糖的硫酸基含量。色譜柱：SH-AC-1陰離子交換柱（苯乙烯和二乙烯基苯共聚物，4.6 mm×250 mm，13 μm）；3.6 mmol/L碳酸鈉和4.5 mmol/L碳酸氫鈉的混合液；流速：1.5 mL/min；電導(dǎo)檢測器檢測；抑制器電流：75 mA；柱溫：35℃；柱壓：5.5 MPa；背景電導(dǎo)：65 μs/cm；進(jìn)樣量：100 μL；采集時(shí)間：12 min。

硫酸根標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密量取硫酸鈉溶液（硫酸根濃度20 μg/mL）8.0、6.0、4.0、3.0、1.0、0.25 mL置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，制成16.0、12.0、8.0、6.0、2.0、0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.4糖醛酸含量測定［9］

以葡萄糖醛酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用咔唑-硫酸法測定糖醛酸含量。

1.2.5軟絲藻多糖的單糖組成分析［10］

本文采用完全酸水解后PMP柱前衍生高效液相色法分析其單糖組成。采用PMP衍生化方法，對等摩爾配制的單糖標(biāo)準(zhǔn)品和各多糖全水解后產(chǎn)物進(jìn)行PMP衍生，然后進(jìn)行液相色譜分析。色譜條件為：色譜柱：Agilent XDB-C18色譜柱；柱溫：35℃；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）/CH3CN（83：17，V：V）；流速：1.0 mL/min；檢測器：DAD（245 nm）。

1.2.6紅外光譜分析

采用KBr壓片法，將約為0.1 mg多糖樣品（減壓干燥48 h）與適量干燥溴化鉀粉末研磨混合均勻后，研制成透明薄片在Nicolet Nexus 470型紅外光譜進(jìn)行測定。紅外光譜儀測定參數(shù)如下：背景掃描次數(shù)：32次；掃描范圍為400～4 000 cm-1；分辨率：4.0 cm-1；檢測器：DTGS。

2　結(jié)果

2.1軟絲藻多糖的提取及相對分子量分析

軟絲藻經(jīng)過熱水提取，Sevag法脫蛋白和透析脫鹽后濃縮凍干得到軟絲藻多糖，多糖呈白色絮狀，相對于軟絲藻干粉，軟絲藻多糖的得率為25%。經(jīng)過Sevag法脫蛋白重復(fù)3次后，軟絲藻多糖的蛋白含量低于5%。通過HPGPC對軟絲藻多糖的分子量分布進(jìn)行分析表明（圖1），軟絲藻多糖根據(jù)分子量主要分為兩大部分，且兩部分分子量差別很大，分別為210 kDa和10 kDa。

圖1　軟絲藻多糖的高效凝膠滲透色譜圖Fig.1　HPGPC chromatogram of polysaccharide from U.fiacca

2.2軟絲藻多糖的硫酸基含量測定

通過離子色譜法對軟絲藻多糖的硫酸基含量進(jìn)行測定。通過對不同濃度的硫酸根標(biāo)準(zhǔn)液的出峰面積進(jìn)行作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=2.054 e5+3.361 e5x，r=0.998 9。將樣品的硫酸基出峰面積代入，換算得到軟絲藻多糖的硫酸基含量為26.2%。說明軟絲藻多糖和其他海洋綠藻來源的多糖一樣，富含硫酸基取代。

2.3軟絲藻多糖的糖醛酸含量測定

富含葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等酸性糖也是海藻多糖的一大特性。對軟絲藻多糖的糖醛酸含量測定表明，軟絲藻多糖中也含有豐富的糖醛酸，含量約為23%，和其他綠藻相比含量較高。

2.4軟絲藻多糖的單糖組成分析

圖2　PMP柱前衍生高效液相色譜圖（A、10種單糖標(biāo)準(zhǔn)品的PMP高效液相色譜圖；B、軟絲藻多糖的PMP高效液相色譜圖）Fig.2　HPLC chromatogram of the PMP precolumn derivative（A.PMP pre-column derivative of 10 monosaccharide standards；B. polysaccharide from U.fiacca）

綠藻多糖的單糖組成較為復(fù)雜，采用PMP柱前衍生液相色譜法可以同時(shí)對多種不同性質(zhì)的單糖進(jìn)行測定。通過和標(biāo)準(zhǔn)圖譜比對（圖2），軟絲藻多糖主要含有鼠李糖和葡萄糖醛酸，甘露糖和葡萄糖含量也比較豐富，另外還含有少量的阿拉伯糖和木糖。其各單糖組成的比率為Man：Rha：GlcUA：Glc：Xyl：Arb=2.7：5.5：5.0：3.2：1.4：1.0。不同來源的海藻多糖其單糖組成存在極大差異，而綠藻多糖相對褐藻和紅藻來源的多糖其組成更加復(fù)雜。根據(jù)所含主要單糖組分，綠藻的水溶多糖可分為兩大類：一類是主要由木糖、半乳糖和阿拉伯糖組成的“木糖-半乳糖-阿拉伯糖聚合物”（xylgalactoarabian），主要存在于松藻、蕨藻和剛毛藻等綠藻種類；另一類主要由葡萄糖醛酸、木糖和鼠李糖組成的“葡萄糖醛酸-木糖-鼠李糖聚合物”（glucuronoxylorhamnan），主要來源于中央頂管藻和石莼目的扁滸苔、石莼、礁膜和尾孢藻中。對絲藻目的綠藻中多糖的單糖組成還未進(jìn)行系統(tǒng)的研究，從單糖組成上來看，軟絲藻多糖富含鼠李糖和葡糖糖醛酸，所以更接近于石莼目的綠藻的單糖組成，但組成上存在一定的差異。其中的甘露糖和阿拉伯糖有可能是其細(xì)胞壁的成分，而葡萄糖可能為胞內(nèi)的能源物質(zhì)［11］。

2.5軟絲藻多糖的紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片，測定軟絲藻多糖紅外光譜的特征。在軟絲藻多糖的紅外譜圖中（圖3）我們可以看到均含有-OH，-CH-，C-O-C等多糖特征吸收峰，另外還存在-COO-和S=O等特征官能團(tuán)的吸收峰［12］，進(jìn)一步證明軟絲藻多糖為含有糖醛酸的硫酸化的多糖，與以上結(jié)果相吻合。紅外光譜的各特征吸收峰歸屬見表1。

圖3　軟絲藻多糖的紅外光譜Fig.3　IR of polysaccharide from U.fiacca

3　結(jié)論

本研究以舟山海域軟絲藻為原料采用熱水提取得到多糖組分。軟絲藻多糖相對于干燥的藻體的提取率為25%。經(jīng)高效凝膠滲透色譜HPGPC測得軟絲藻多糖組分分布相對單一，主要含有兩大組分，分子量分別為210 kDa、58.4 kDa和10 kDa。理化性質(zhì)研究表明軟絲藻多糖組分經(jīng)脫蛋白后蛋白含量低于5%，硫酸基含量為26.2%，糖醛酸含量為23%，為富含糖醛酸的硫酸酯化多糖。液相色譜測定表明軟絲藻多糖主要由鼠李糖和葡萄糖醛酸組成，其次為甘露糖和葡萄糖，還含有木糖和阿拉伯糖。該結(jié)果表明軟絲藻多糖具有獨(dú)特理化性質(zhì)的酸性硫酸多糖，具有深入研究開發(fā)的價(jià)值，而本文的理化性質(zhì)研究為軟絲藻多糖的結(jié)構(gòu)和活性研究提供基礎(chǔ)。

表1　軟絲藻多糖組分紅外光譜分析Tab.1　The IR spectra assignment of polysaccharide from Ulothrix fiacca

［1］陳錫林.浙江海洋藥用藻類資源調(diào)查研究初報(bào)［J］.浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，24（2）：65-67.

［2］CASSOLATO J E F，NOSEDA M D，PUJOL C A，et al.Chemical structure and antiviral activity of the sulfated heterorhamnan isolated from the green seaweed Gayralia oxysperma［J］.Carbohydrate Research，2008，343：3 085-3 095.

［3］HARADA N，MAEDA M.Chemical structure of antithrombin-active rhamnan sulfate from Monostroma nitidum［J］.Bioscience Biotechnology Biochemistry，1998，62：1 647-1 652.

［4］LEE J B，KOIZUMI S，HAYASHI K，et al.Structure of rhamnan sulfate from the green alga Mnonostroma nitidum and its antiherpetic effect［J］.Carbohydrate Polymers，2010，81：572-577.

［5］KARNJANAPRATUM S，YOU S G.Molecular characteristics of sulfated polysaccharides from Monostroma nitidum and their in vitro anticancer and imonodulatory activities［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2011，48：311-318.

［6］李苗苗，于廣利，吳建東，等.多肋藻（Costaria costata）多糖的提取分離及理化性質(zhì)分析［J］.中國海洋藥物，2011，30（1）：1-5.

［7］殷秀紅，趙峽，張紫恒，等.紫貽貝多糖的提取、分離和基本理化性質(zhì)分析［J］.中國海洋藥物，2011，30（2）：12-18.

［8］WANG S H，RAPTS E，YEH J.Ion chromatography for the determination of sulfate in Stealth liposome［J］.Journal of？Chromatography A，2004（1039）：51-58.

［9］BITTER T，MUIR H M.A modified uronic acid carbazole reaction［J］.Analytical Biochemistry，1962，4：330-334.

［10］CHEN Y，MAO W J，YANG Y P.Structure and antioxidant activity of an extracellular polysaccharide from coral-associated fungus，Aspergillus versicolor LCJ-5-4［J］.Carbohydrate Polymers，2012（87）：218-226.

［11］李紅燕.寬礁膜抗凝血活性多糖及其寡糖的制備和結(jié)構(gòu)研究［D］.青島：中國海洋大學(xué)，2011.

［12］QI X H，MAO W J，YAN G Y.Chemical characteristic of an anticoagulant-active sulfated polysaccharide from Enteromorpha clathrata［J］.Carbohydrate Polymers，2012，90（4）：1 804-1 810.

Extraction and Physicochemical Analysis of Polysaccharides from Ulothrix fiacca

ZHANG Ze-feng，WANG Chen-xu，PEI Rui，et al
（Food and Medical School of Zhejiang Ocean University，Zhoushan316022，China）

The polysaccharide was extracted from the marine green algae Ulothrix fiacca derived from sea region of Zhoushan.The Yields of the polysaccharide were about 25%.The analysis of the physicochemical characters showed that the polysaccharide was sulfated and acidic polysaccharide.The contents of sulfate ester and glucuronic acid were 26%and 23%respectively.The monosaccahride composition of the polysaccharide was Man，Rha，GlcUA，Glc，Xyl and Arb at the ratio of 2.7：5.5：5.0：3.2：1.4：1.0.The main distribution of the molecular weight of the polysaccharide was at 210 kDa and 10 kDa.

Ulothrix fiacca；polysaccharide；physicochemical character

R931.77

A

1008-830X（2015）04-0340-04

2015-04-24

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LQ14H300001）；浙江省教育廳科研基金項(xiàng)目（Y201328477）

張澤峰（1991-），男，山東呂梁人，研究方向：海洋藥物.E-mail：18268732702@163.com

陳蔭.E-mail：mojojo1984@163.com