腺病毒介導(dǎo)的DPP6過表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的鑒定

王　娜，　華　樂，　楊　甫，　王　玨，　王志華，王　瓊，　董　梅，　王　川（.河北醫(yī)科大學(xué)　藥理學(xué)教研室，河北　石家莊　05007；.河北醫(yī)科大學(xué)　臨床醫(yī)學(xué)系，河北石家莊　05007；.河北科技大學(xué)校醫(yī)院，河北　石家莊　05008）

腺病毒介導(dǎo)的DPP6過表達(dá)載體的構(gòu)建及其在大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的鑒定

王娜1，華樂2，楊甫2，王玨2，王志華1，王瓊1，董梅3，王川1
（1.河北醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，河北石家莊050017；2.河北醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)系，河北石家莊050017；3.河北科技大學(xué)校醫(yī)院，河北石家莊050018）

目的：構(gòu)建腺病毒介導(dǎo)的DPP6過表達(dá)載體并驗(yàn)證其在大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá).方法：應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因DPP6，經(jīng)酶切、連接等反應(yīng)將目的基因插入穿梭載體pShuttle-CMV中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化至含有AdEasy質(zhì)粒的大腸桿菌中，進(jìn)行重組；所產(chǎn)生的腺病毒載體轉(zhuǎn)染在HEK-293細(xì)胞中，進(jìn)行腺病毒的包裝、分泌和擴(kuò)增，所得病毒感染大鼠心肌細(xì)胞，進(jìn)行熒光及實(shí)時定量PCR（qPCR）鑒定.結(jié)果：DPP6過表達(dá)腺病毒載體構(gòu)建成功，經(jīng)HEK293細(xì)胞包裝、擴(kuò)增后，所得病毒可成功感染初生大鼠心肌細(xì)胞，觀測到腺病毒攜帶的綠色熒光蛋白表達(dá)，qPCR檢測DPP6 mRNA表達(dá)明顯升高.結(jié)論：成功構(gòu)建了腺病毒介導(dǎo)的DPP6過表達(dá)載體，并在大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究DPP6在心肌細(xì)胞內(nèi)的功能奠定了基礎(chǔ).

DPP6基因；腺病毒載體；實(shí)時定量PCR；綠色熒光蛋白；心肌細(xì)胞

二肽基肽酶樣蛋白（Dipeptidy peptidase-like protein，DPP）亞型6（DPP6）是一類單次跨膜蛋白［1－5］，最近的研究提示1種家族特發(fā)性室顫的發(fā)生與DPP6的表達(dá)異常密切相關(guān)，但其致病機(jī)制尚不明確［5－6］.最近研究人員發(fā)現(xiàn)DPP6可與構(gòu)成A-type鉀通道的核心亞基Kv4相耦聯(lián)，并調(diào)節(jié)Kv4的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，并推測DPP6基因的過表達(dá)可能導(dǎo)致鉀通道功能異常，進(jìn)而導(dǎo)致心律失常發(fā)生［7］.在原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞中，研究某基因功能常用手段是通過腺病毒包裹某目的基因?qū)胄募〖?xì)胞的方法，實(shí)現(xiàn)過表達(dá)此基因的效果.本實(shí)驗(yàn)擬通過構(gòu)建小鼠DPP6基因過表達(dá)重組腺病毒載體，使其在小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，為進(jìn)一步研究DPP6基因過表達(dá)導(dǎo)致室顫的機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1　材料與方法

1.1材料

（1）質(zhì)粒和菌種AdEasy腺病毒表達(dá)系統(tǒng)和穿梭載體pShuttle-CMV（clontech公司）；DPP6-pFLC1質(zhì)粒（含人DPP6基因）；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α（Takala，日本）；HEK293細(xì)胞（中科院細(xì)胞庫）.

（2）試劑酶：DNA重組所需的各種限制性內(nèi)切酶及PCR反應(yīng)體系的Taq酶（Takala，日本）.質(zhì)粒DNA提取試劑盒（TIANGEN公司）；DNA膠回收試劑盒（Promega公司）；腺病毒純化試劑盒（Pro-mega公司）.PCR引物由上海生工合成.

1.2方法

（1）DPP6基因的獲取用PCR方法擴(kuò)增目的基因DPP6（GenBank NM＿130797.3）.根據(jù)載體及質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)要求，引物設(shè)計(jì)時分別在5′端引入酶切位點(diǎn)EcoRV、在3′端引入酶切位點(diǎn)Xho I.引物設(shè)計(jì)如下：DPP6 F 5′-CCCTCGAGATGAAGGAAAAG-GCCATG-3′，DPP6 R 5′-CTGCTCCTCCTCCTGATTC-TATAGGG-3′.PCR反應(yīng)體系50 μL，包含：DPP6 F 1 μL，DPP6 R 1 μL，DPP6-pFLC1 1 μL，Taq 0.5 μL，5 ×buffer 10 μL，dNTP 4 μL，ddH2O 32.5 μL.反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，30次循環(huán)，72℃10 min結(jié)束.PCR產(chǎn)物測序鑒定，經(jīng)膠回收純化后得到DPP6片段，保存?zhèn)溆?

（2）含有Dpp6基因的穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建pShut-tle-CMV載體、Dpp6片段分別經(jīng)EcoRV和Xhol雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4 DNA ligase，16℃連接過夜.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于卡那抗性LB瓊脂糖平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑單克隆搖菌提質(zhì)粒.全部質(zhì)粒分別用PCR和雙酶切初步鑒定，將鑒定后的陽性克隆送樣測序，成功得到克隆pShuttle-CMV-Dpp6.

（3）含Dpp6基因重組腺病毒質(zhì)粒的制備將pShuttle-CMV-Dpp6用Pme1線性化，然后用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)入pAdEasy-BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，使其在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組后，涂布于卡那抗性的LB瓊脂糖平板，37℃過夜培養(yǎng)，得到多個陽性克隆，挑單克隆搖菌提質(zhì)粒.質(zhì)粒全部經(jīng)Pac I單酶切鑒定，成功獲得pShuttle-Dpp6-AdEasy質(zhì)粒.

（4）重組Dpp6基因腺病毒的包裝和擴(kuò)增按照LipofectamineTM2000說明書，轉(zhuǎn)染Pac I線性化的pShuttle-Dpp6-AdEasy質(zhì)粒DNA至70%～80%融合的HEK293細(xì)胞中.24～48 h后觀察細(xì)胞綠色熒光表達(dá)情況.10～15 d后可見所有細(xì)胞均呈懸浮狀態(tài)，此時收集細(xì)胞，用PBS重懸.－70℃和37℃反復(fù)凍融3次，釋放病毒，離心后收集上清，再感染HEK-293細(xì)胞，大量擴(kuò)增腺病毒.

（5）腺病毒體外感染大鼠心肌細(xì)胞及熒光顯微鏡鑒定新生大鼠心肌組織經(jīng)0.25%胰酶消化后接種在多聚賴氨酸預(yù)處理的玻片上，1d后當(dāng)細(xì)胞完全貼壁并融合至80%～90%時，加入不同稀釋度的腺病毒感染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行細(xì)胞固定及熒光顯微鏡照相鑒定.

2　結(jié)果

2.1DPP6基因的克隆

首先從DPP6-pFLC1質(zhì)粒中克隆出含有特定酶切位點(diǎn)（EcoRV和 Xho1）的 DPP6基因片段.如圖1所示，用PCR方法從DPP6-pFLC1質(zhì)粒中克隆出含有特定酶切位點(diǎn)的DPP6基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后可見一大小約為2 400 bp的條帶，與目的基因DPP6大小一致.PCR產(chǎn)物測序后與GenBank數(shù)據(jù)庫中DPP6（NM＿130797.3）比對，一致性為100%，證明DPP6基因片段擴(kuò)增正確.

圖1　DPP6基因的克隆1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖Fig.1　Amplification of DPP gene

2.2pShuttle-CMV-Dpp6載體的構(gòu)建

將測序正確的DPP6片段與載體pShuttle-CMV連接，得到pShuttle-CMV-Dpp6質(zhì)粒.為進(jìn)一步驗(yàn)證連接產(chǎn)物的正確性，通過雙酶切（Xho I和EcoR V）反應(yīng)來鑒定以上連接產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示：pShut-tle-CMV-Dpp6質(zhì)粒經(jīng)Xho I和EcoR V雙酶切后得到2 400 bp和約7 500 bp大小的兩條條帶，與預(yù)期產(chǎn)物大小相符（圖2）.

圖2　雙酶切鑒定　pShuttle-CMV-Dpp6載體的電泳結(jié)果Fig.2　Double digestion of pShuttle-CMV-Dpp6

2.3DPP6過表達(dá)腺病毒載體（pShuttle-Dpp6-AdEasy）的構(gòu)建

線性化的pShuttle-CMV-Dpp6轉(zhuǎn)入 pAdEasy-BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中發(fā)生同源重組，在卡那抗性的LB瓊脂糖平板上長出多個陽性克隆（圖3A、3B）.單克隆提質(zhì)粒后經(jīng)Pac I單酶切鑒定，出現(xiàn)3.0 kb 或4.5 kb片段的質(zhì)粒即為正確重組質(zhì)粒pShuttle-Dpp6-AdEasy（圖3C）.

圖3　挑選并鑒定　DPP6過表達(dá)腺病毒載體（pShuttle-Dpp6-AdEasy）Fig.3　Pick and screen DPP6 overexpression adenovirus plasmid

2.4DPP6過表達(dá)腺病毒在HEK293細(xì)胞中的包裝、分泌、擴(kuò)增及其mRNA表達(dá)水平的鑒定

將pShuttle-Dpp6-AdEasy質(zhì)粒用Pac I單酶切線性化，并將其用Lipofectamine轉(zhuǎn)染至HEK-293細(xì)胞中，持續(xù)培養(yǎng)10～15 d，可觀測到所有細(xì)胞均呈懸浮狀態(tài)，滿視野細(xì)胞均可見綠色熒光蛋白的表達(dá).（圖4）.用此制備的DPP6過表達(dá)腺病毒感染HEK293細(xì)胞后，經(jīng)qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照腺病毒（僅含GFP）相比，DPP6 mRNA表達(dá)明顯升高（圖5）.

圖4　DPP6過表達(dá)腺病毒在HEK293細(xì)胞中的包裝、分泌和擴(kuò)增Fig.4　Packing and amplifying DPP6 adenovirus in HEK293cells

圖5　DPP6過表達(dá)腺病毒在　HEK293細(xì)胞中內(nèi)　mRNA表達(dá)的鑒定Fig.5　mRNA expression of DPP6 in HEK293 cells overexpres-sion either adenovirus（GFP）or DPP6-adenovirus

2.5DPP6過表達(dá)腺病毒在初生大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的鑒定

用所獲得的DPP6過表達(dá)腺病毒感染培養(yǎng)的初生大鼠心肌細(xì)胞，可觀測到腺病毒攜帶的綠色熒光蛋白在心肌細(xì)胞內(nèi)有明顯表達(dá)（圖6）.

圖6　DPP6過表達(dá)腺病毒在初生大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的熒光鑒定Fig.6　Fluorescence measurement of GFP in neonatal rat cardiomyocytes infected with DPP6 adenovirus

3　討論

本研究利用AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)成功構(gòu)建了腺病毒介導(dǎo)的DPP6過表達(dá)載體，并在初生大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究DPP6在心肌細(xì)胞內(nèi)的功能奠定了基礎(chǔ).

腺病毒載體作為極具潛力的哺乳動物基因表達(dá)載體，已有廣泛應(yīng)用，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)40多種不同血清型和93種不同種類的腺病毒［8－11］，其具有以下優(yōu)點(diǎn)：①宿主廣泛；②目的基因表達(dá)效率高；③外源基因容量大；④無插入致突變性.但缺點(diǎn)是制備手段繁雜，效果不穩(wěn)定.2007年，Luo等［12］將重組腺病毒技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，建立新一代AdEasy腺病毒載體系統(tǒng)，使其成為目前病毒干擾技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的一種病毒載體系統(tǒng).和傳統(tǒng)的重組腺病毒載體系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)采用細(xì)菌內(nèi)同源重組，重組效率高.方法簡單快速，大大減少了病毒的制備時間.本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的攜帶人Dpp6基因編碼區(qū)序列的重組腺病毒質(zhì)粒.酶切及測序分析顯示帶有的Dpp6基因與GenBank中已公布序列吻合，保證了其正常的生理功能.在同源重組過程中，其穿梭載體Pshuttle-CMV攜帶GFP報(bào)告基因，可重組整合至腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy中表達(dá)，并且由雙啟動子各自啟動GFP和目的基因的表達(dá).因而既可通過GFP對病毒的重組過程進(jìn)行追蹤，對病毒轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行觀察；又避免了其他腺病毒體系要么無法示蹤，要么為了示蹤而制備報(bào)告基因和目的基因的融合基因而帶來的種種問題.得到的人Dpp6重組腺病毒不僅可以有效感染其宿主包裝細(xì)胞系293細(xì)胞，而且對于心肌細(xì)胞等原代細(xì)胞的感染效率也很好，本實(shí)驗(yàn)利用此技術(shù)，成功構(gòu)建了DPP6腺病毒過表達(dá)載體，并通過綠色熒光蛋白表達(dá)驗(yàn)證及mRNA檢測證明了此腺病毒對心肌細(xì)胞的有效感染性，這為進(jìn)一步研究DPP6的在心肌細(xì)胞內(nèi)的功能打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ).

DPP6，二肽基肽酶樣蛋白（Dipeptidyl peptidase-like protein，DPP）亞型6，DPP6在蛋白結(jié)構(gòu)上與DP-PIV具有一定的相似性，又稱為DPPIV樣（DPPIV-like，DPPL）蛋白，歸屬于單次跨膜的絲氨酸蛋白酶（serine protease）的亞家族［13］.從結(jié)構(gòu)上看，DPP6具有一次跨膜結(jié)構(gòu)，不具有任何蛋白酶活性.最近的研究發(fā)現(xiàn)一種家族特發(fā)性室顫的發(fā)生與DPP6的異常表達(dá)升高密切相關(guān)，但其詳細(xì)的致病機(jī)制目前仍不清楚［6］.雖然Dpp6是一種公認(rèn)的Kv4通道調(diào)節(jié)亞基，而且Kv4通道與心肌動作電位的形成密切相關(guān)，但DPP6在心肌細(xì)胞內(nèi)的研究很少有報(bào)道［7］.本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建DPP6腺病毒過表達(dá)載體，從而為在心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)DPP6提供有效手段，從而為揭示DPP6在心臟中的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

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［責(zé)任編輯：劉蔚綏］

Construction of adenovirus mediated DPP6 overexpression vector and its identification in rat cardiomyocytes

WANG Na1，HUA Yüe2，YANG Fu2，WANG Jüe2，WANG Zhihua1，
WANG Qiong1，DONG Mei3，WANG Chuan1
（1.Department of Pharmacology，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；2.Department of Clinic Medicine，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China；
3.The Affiliated Hospital of Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China）

Aim：To construct adenovirus mediated DPP6 overexpression vector and to evaluate its expression in rat cardiomyocytes.Methods：DPP6 gene was amplified by PCR technique and inserted into pShuttle-CMV vector by enzyme digestion and ligation.DPP6-pShuttle-CMV constructor was transformed into E.coli BJ5183 strain containing AdEasy vector for recombination.The produced adenovirus constructor was transfected into HEK-293 cells to package，secret and amplify adenovirus，which was further infected cultured rat cardiomyocytes and identified by fluorescence and real-time PCR.Results：We successfully get DPP6 overexpression adenovirus constructor.The produced virus was identified in neonatalrat cardiomyocytes.GFP was observed in infected cardiomyocytes.DPP6 mRNA expression was markedly increased in DPP6 virus infected cells.Conclusion：Adenovirus mediated DPP6 overexpression vector was successfully constructed and its expression was evaluated in rat cardiomyocytes，which will facilitate further functional studies of DPP6 in cardiomyocytes.

DPP6 gene；adenovirus vector；real-time PCR；GFP；cardiomyocytes

R33；R34；R54

A

1000－9965（2015）06－0453－05

10.11778/j.jdxb.2015.06.003

2015－09－10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171097）；河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2014206419）；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金項(xiàng)目（2013－693）；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目重點(diǎn)項(xiàng)目（ZD2015007）和自籌項(xiàng)目（Z2015005）.

王娜（1980－），女，碩士，講師，研究方向：心血管藥理學(xué)

王川（1971－），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，Tel：0311－86261031，E-mail：wangchuan＠hebmu.edu.cn