連接酶檢測(cè)反應(yīng)技術(shù)應(yīng)用于乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥和阿德福韋耐藥突變的研究

單幼蘭，　江培學(xué)（.重慶醫(yī)科大學(xué)　附屬第二醫(yī)院　肝病實(shí)驗(yàn)室，重慶　400038；.復(fù)旦大學(xué)　附屬華山醫(yī)院　感染科，上?！?033）

連接酶檢測(cè)反應(yīng)技術(shù)應(yīng)用于乙型肝炎病毒拉米夫定耐藥和阿德福韋耐藥突變的研究

單幼蘭1，江培學(xué)2
（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝病實(shí)驗(yàn)室，重慶400038；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海200233）

目的：研究高溫連接酶檢測(cè)反應(yīng)技術(shù)（LDR）技術(shù)檢測(cè)乙肝病毒拉米夫定耐藥和阿德福韋耐藥突變的可行性.方法：應(yīng)用LDR技術(shù)和多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)，在乙肝病毒基因相關(guān)區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針檢測(cè)突變位點(diǎn).結(jié)果：該方法能很好的區(qū)分野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒；90例臨床樣本的測(cè)序結(jié)果與LDR檢測(cè)結(jié)果基本一致.結(jié)論：LDR技術(shù)可以應(yīng)用于臨床乙肝病毒樣本的拉米夫定耐藥和阿德福韋耐藥的檢測(cè).

乙肝病毒；拉米夫定；阿德福韋；耐藥突變

據(jù)估計(jì)，全球有3.5億人患有慢性乙肝，2006年全國(guó)人群乙肝等有關(guān)疾病血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，中國(guó)人群乙肝表面抗原攜帶率為7.18%，大概有9 300萬(wàn)的乙肝感染者.2011年病毒性肝炎HBV（Hepatitis B Virus）報(bào)告發(fā)病例數(shù)中乙肝占到80%［1－4］.HBV的反復(fù)感染，可能導(dǎo)致慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌，積極的抗病毒治療可以有效提高患者的生存質(zhì)量.拉米夫定（Lamivudine，LMD）是迄今我國(guó)用于乙型肝炎治療的主要首選藥物之一；阿德福韋酯（Adefovir，ADV）是新一代抗乙型肝炎病毒新藥，可以有效抑制HBV在肝細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制.然而，隨著臨床服藥時(shí)間的延長(zhǎng)，拉米夫定與阿德福韋酯的耐藥率會(huì)顯著提高.常見(jiàn)的拉米夫定耐藥位點(diǎn)是L180M和M204I/V（YIDD/YVDD）；常見(jiàn)的阿德福韋耐藥位點(diǎn)是A181V/T和N236T.因此臨床上急需一種靈敏性高、特異性好的方法檢測(cè)拉米夫定與阿德福韋酯耐藥［5－7］.本研究建立了一種基于連接酶檢測(cè)反應(yīng)技術(shù)的拉米夫定與阿德福韋酯耐藥突變檢測(cè)方案，將為臨床HBV耐藥的診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1　資料與方法

1.1資料與材料

（1）病例資料收集2009年至2012年在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院進(jìn)行抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者樣本180例，其中90例患者服用拉米夫定治療2年、90例患者用阿德福韋治療3年.男97例，女83例，年齡39～58歲；HBeAg（e抗原）陽(yáng)性患者145例，抗HBeAg陽(yáng)性35例，平均丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）水平為（79.8±53.1）IU/L，平均HBV DNA水平（log10拷貝數(shù)/mL）為5.75.上述研究病例獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；相關(guān)患者都簽署了知情同意書.本研究中慢性乙型肝炎特征為：乙型肝炎表面抗原陽(yáng)性，且至少6個(gè)月；血清HBV DNA＞10 000 IU/mL；ALT水平升高或反復(fù)升高.患者血清分離后－70℃保存?zhèn)溆?

（2）儀器及試劑熒光定量PCR儀為L(zhǎng)ife Technology公司ABI7500，HBV DNA定量試劑盒和HBV cccDNA定量試劑盒均購(gòu)自上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司（復(fù)星診斷）.MJ-90 PCR購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司，ABI3130測(cè)序儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司.

1.2方法

（1）HBV DNA定量檢測(cè)采用ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)，試劑由上海星耀醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司提供.按照HBV DNA定量試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行.取血清100 μL加入等量DNA提取液A，混勻后143 00 g離心10 min，去除上清后加50μL DNA提取液B，混勻后100℃煮沸10 min，離心后取上清即為總HBV DNA.提取產(chǎn)物做實(shí)時(shí)熒光多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ploymerase chain reaction，PCR），由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出HBV DNA的定量濃度值.

（3）連接酶方法的引物和探針引物探針堿基序列及表度（表1）.

表1　引物探針序列Table 1　Primers and Probes

（3）測(cè)序方法的引物和探針測(cè)序的引物提供給Invitrogen司合成并完成測(cè)序，測(cè)序引物如下：

5′-CATTTGTTCAGTGGTTCGTA-3′；

5′-CAAAAGAAAATTGGTAACAGCGGTA-3′

PCR條件為：94℃ 4 min，30個(gè)循環(huán)94℃ 10 sec；60℃45 sec；72℃ 1 min.PCR產(chǎn)物送Invitrogen做測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI上分析比對(duì).

（4）PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增體系包括濃度為10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷（Tris），HCl（pH＝8.3）、濃度分別為50 mmol/L KCl、2.0 nmol/L MgCl2、200 tx mol/L dNTP、300 nmol/L引物、1.5 U熱啟動(dòng)Taq酶、5 μL DNA模板，總反應(yīng)體積為50 L.反應(yīng)條件為：首先在95℃反應(yīng)10 min以激活熱啟動(dòng)酶，然后95℃ 30 s，54℃ 50 s，72℃ 60 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min.

（5）LDR檢測(cè)LDR緩沖溶液中加入2 μL PCR產(chǎn)物、濃度為0.1 mmol/L DNA連接酶，總反應(yīng)體積為20 μL.反應(yīng)條件為：95℃2 min，然后95℃15 s，50℃20 s，循環(huán)3O次.擴(kuò)增完成后加入0.5 μL濃度為0.5 mmol/L的EDTA使反應(yīng)終止.取2.5 μL反應(yīng)產(chǎn)物與等體積上樣緩沖液混合，然后在94℃變性2 min，迅速在冰上冷卻，立即加入ABI Prism 3130測(cè)序儀變性凝膠進(jìn)行電泳30 min.

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

電泳結(jié)果采用Genemapper 4.0軟件進(jìn)行分析.

2　結(jié)果

2.1對(duì)照質(zhì)粒檢測(cè)結(jié)果

首先對(duì)含有HBV rtA181位點(diǎn)突變型及野生型的質(zhì)粒分別進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，均得到預(yù)期的檢測(cè)結(jié)果，與野生型質(zhì)粒沒(méi)有交叉擴(kuò)增.

將含有是L180M、M204I/V、A181V/T和N236T的質(zhì)粒分別稀釋成106、105、104、103及102拷貝/mL進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)檢測(cè)反應(yīng)重復(fù)3次.其中10拷貝/mL以上的質(zhì)粒均能穩(wěn)定地檢出突變，但102拷貝/mL的質(zhì)粒則至少有1次未能有檢測(cè)結(jié)果，因此可以認(rèn)為本方法檢測(cè)的敏感性為103拷貝/mL.以甲型肝炎病毒（HAV）RNA、丙型肝炎病毒（HCV）RNA及人巨細(xì)胞?。℉CMV）DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)，未檢測(cè)到陽(yáng)性信號(hào).

圖1　181突變型質(zhì)粒Fig.1　181mutation-type plasmid

圖2　236突變型質(zhì)粒Fig.2　236 mutation-type plasmid

2.2臨床樣本LDR檢測(cè)

90例拉米夫定治療的臨床樣本中LDR共檢出43例突變樣本，其中YIDD（204I）14例YVDD （204V）23例，L180M6例，其中又包括YIDD和L180M變異3例；YIDD和L180M變異4例；YIDD 和YMDD變異5例.90例阿德福韋治療的臨床樣本中LDR共檢出8例突變樣本，其中A181V/T4例，N236T3例，A181V/T和N236T變異1例.

圖3　YIDD變異和A181V/T變異Fig.3　YIDD mutation and A181V/T mutation

圖4　A181V/T變異和N236T變異Fig.4　A181V/T mutation and N236T mutation

2.3Sanger法測(cè)序驗(yàn)證

LDR-PCR法對(duì)90例拉米夫定治療的臨床樣本中共檢出40例突變樣本，其中YIDD（204I）13例，YVDD（204V）21例，L180M6例，其中又包括YIDD 和L180M變異3例；YVDD和L180M變異 3例；YIDD和YMDD變異5例.我們用測(cè)序法對(duì)90例阿德福韋治療的臨床樣本中PCR-LDR法共檢出的8例突變樣本進(jìn)行驗(yàn)證，其中A181V/T4例，N236T3例，LDR法中的A181V/T和N236T變異未檢測(cè)到.最終兩種方法的不一致的有4例，分別是YIDD1例、YVDD 2例以及阿德福韋混合變異1例.兩種方法的符合率為92.16%.

表2　測(cè)序法驗(yàn)證Table 2　Sequencing verifcation

2.4對(duì)4例LDR與測(cè)序不一致的標(biāo)本進(jìn)行亞克隆測(cè)序確認(rèn).每例標(biāo)本挑選20個(gè)亞克隆進(jìn)行測(cè)序分析，分別發(fā)現(xiàn)有4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)和5個(gè)亞克隆含有突變序列，與LDR的檢測(cè)結(jié)果一致.

3　討論

慢性乙型肝炎治療的總體目標(biāo)是最大限度地長(zhǎng)期抑制HBV，減輕肝細(xì)胞炎癥壞死及肝纖維化，延緩和減少肝功能失代償、肝硬化、HCC及其并發(fā)癥的發(fā)生，核苷（酸）類抗HBV藥物長(zhǎng)期治療，可導(dǎo)致耐藥的發(fā)生，進(jìn)而出現(xiàn)肝炎復(fù)發(fā)，甚至肝功能衰竭死亡，或肝硬化/肝功能失代償?shù)葒?yán)重并發(fā)癥.因此，臨床上需要靈敏的方法檢測(cè)耐藥突變，以便及早調(diào)整治療方案.拉米夫定和阿德福韋是目前治療慢性乙型肝炎的一線藥物之一，但隨著治療時(shí)問(wèn)的延長(zhǎng)其耐藥突變率也逐漸提高.拉米夫定治療第1年、2年、3年、4年耐藥比例為分別為14%、38%、49%、66%）［1］.阿德福韋治療2、3和5年的耐藥率分別為2.0%、5.9%和29.0%［8－11］.

盡管有多種方法可以用來(lái)監(jiān)測(cè)拉米夫定和阿德福韋耐藥突變，但臨床上應(yīng)用最多的還是測(cè)序法和線性探針?lè)聪螂s交技術(shù)（Line probe assay，LiPA）.測(cè)序法敏感性較低，只能檢測(cè)到病毒群體中20%以上的突變株，不能進(jìn)行高通量檢測(cè)，且其結(jié)果判斷需要對(duì)測(cè)序圖譜進(jìn)行認(rèn)真細(xì)致的分析.LiPA由于價(jià)格昂貴，不適合在HBV高度流行的發(fā)展中國(guó)家大面積推廣.LDR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于單核苷酸多態(tài)性分析，并且成功應(yīng)用于低比例HBV拉米夫定耐藥突變株的檢測(cè)，可以檢測(cè)到HBV群體中1%的YIDD變異株［11－14］.

高溫連接酶檢測(cè)反應(yīng)技術(shù)（ligase detection reac-tion，LDR）是一種新興的單核苷酸多態(tài)性（single nu-cleotide polymorphism，SNP）分型檢測(cè)方法.其原理是高溫連接酶檢測(cè)到模板DNA與兩條探針DNA的接頭處存在著堿基錯(cuò)配，則連接反應(yīng)不能進(jìn)行；即如果探針與模板有一個(gè)堿基不配對(duì)，連接反應(yīng)不能進(jìn)行，如果探針與模板完全互補(bǔ)，連接反應(yīng)完成.與其它檢測(cè)技術(shù)相比，LDR檢測(cè)技術(shù)擁有準(zhǔn)確度高、通用性強(qiáng)、通量大、操作簡(jiǎn)單、成本低等眾多明顯優(yōu)勢(shì)［15－18］.

本研究檢測(cè)的標(biāo)本均來(lái)自接受拉米夫定和阿德福韋治療3年以上且血清HBV DNA濃度大于103拷貝/mL的患者.90例拉米夫定治療患者中共有43例（47.78%）檢出拉米夫定耐藥突變，且有32例出現(xiàn)臨床耐藥，90例阿德福韋治療患者中共有8例（8.89%）檢出阿德福韋耐藥突變，且有5例出現(xiàn)臨床耐藥，結(jié)果表明長(zhǎng)期接受拉米夫定和阿德福韋治療仍然沒(méi)有產(chǎn)生病毒學(xué)完全應(yīng)答的患者發(fā)生耐藥突變的比例比較高.本方法應(yīng)用于拉米夫定和阿德福韋治療的耐藥監(jiān)測(cè)，有助于早期發(fā)現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，合理確定治療方案.

核苷（酸）類藥物治療期間耐藥發(fā)生是不可完全避免的，選用適當(dāng)?shù)乃幬锖蛢?yōu)化治療方案可以最大程度地預(yù)防和延緩耐藥的發(fā)生.一旦發(fā)生耐藥，如果不及時(shí)發(fā)現(xiàn)，將給治療方案帶來(lái)盲目性，因此，特異性好、靈敏度高的耐藥檢測(cè)方法對(duì)提高臨床用藥針對(duì)性具有很好的指導(dǎo)意義.

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)、肝病分會(huì).病毒性肝炎防治方案［J］.中華肝臟病雜志，2000，8（6）：324－329.

［2］中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）［J］.中華傳染病雜志，2011，29：65－80.

［3］張繼明，劉芳，尹有寬，等.拉米夫定治療前后 HBV全基因序列檢測(cè)對(duì)比［J］.中華傳染病雜志，2003，21：260 264.

［4］劉傳苗，張欣欣，陸志檬.拉米夫定治療中乙型肝炎病毒YMDD野毒株和變異株的變化［J］.肝臟，2004，9 （2）：73－76.

［5］劉錦屏，劉友德，楊紹萍，等.煙臺(tái)地區(qū)原發(fā)性肝癌患者乙肝病毒基因型分析［J］.中華保健醫(yī)學(xué)雜志，2010，（12）：355－57.

［6］張智，張珍，李楠，等.185例廣東人乙型肝炎病毒基因分型及耐藥基因檢測(cè)［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2008，29 （1）：797－98.

［7］左興，謝奇峰，楊林，等.廣東地區(qū)HBV基因型在家庭集聚感染中的分布及意義［J］.中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2009，30（35）：19－23.

［8］GHANY M，LIANG T J.Drug targets and molecular mechanisms of drug resistance in chronic hepatitis B［J］.Gastroenterology，2007，132（4）：1574－1585.

［9］HADZIYANNIS S J，TASSOPOULOS N C，HEATH-COTE E J，et al.Long-term therapy with adefovir dipivox-il for HBeAg-negative chronic hepatitis B［J］.N Engl J Med，2005，352（26）：2673－2681.

［10］HADZIYANNIS S J，TASSOPOULOS N C，HEATHEOTE E J，et al.Long-term therapy with adefovir dipivoxil for HBeAg-negative chronic hepatitis B for upto 5 years［J］.Gastroenterology，2006，131（6）：1743－1751.

［11］張欣欣，于德敏.乙型肝炎病毒耐藥及檢測(cè)［J］.肝臟，2007，12：25－27.

［12］WESTLAND C E，YANG H，DELANEY W E，et al.Ac-tivity of adefovir dipivoxil against all patterns of lam ivudi-ne resistant hepatitis B virusesin patients［J］.J Viral Hepat，2005，12（1）：67－73.

［13］LOK A S，ZOULIM F，LOCARNINI S，et al.Antiviral drug-resistant HBV：standardization of nomenclature an-dass ys and recommendations for management［J］.Hepa-tology，2007，46（1）：254－265.

［14］KHANNA M，CAO W，ZIRVI M，et al.Ligase detectionre-action for identi6cation of low abundance mutations［J］.Clin Biochem，1999，32（4）：287 290

［15］XIAO Z，XIAO J，JIANG Y.A novel method based on lig-ase detection reaction for low abundant YIDD mutants det-edtion in hepatitis B virus［J］.Hepatology Res，2006，34 （3）：150－155.

［16］WANG Y Z，XIAO J H，RUAN L H，et al.Detection of the rtA181V/T and rt236T nutations associated with re-sistance to adefovir dipivoxil using a ligase detection reatction assay［J］.Clin Chim Acta，2009，408（1/2）：70 －74.

［17］MATETZKY S，SHARIR T，DOMINGOM，et al.Elevated troponin Ilevel on admission is associated with adverse outcome of prim ary angioplasty in acute myocardial in-farction［J］.Circulation，2000，102（14）：1617－1616.

［18］ORITO E，ICHIDA T，SAKUGAWA H，et al.Geograph-ic distribution of hepatitis B virus（HBV）genotype in pa-tients with chronic HBV infection in Japan［J］.Hepatolo-gy，2001，34（3）：590－594.

［19］KRUCOFF M W，JOHANSON P，BAEZA R，et al.Clinical utility of serial and continuous ST segment recovery as-sessment in patients with acute ST elevation m yocardial infarction：assessing the dynamics of epieardial and myo-cardial reperfusion［J］.Circulation，2004，110（25）：533 －539.

［20］SCHULTZ U，CHISARI F V.Recombinant duck interfer-on gamma inhibits duck hepatitis B virus replication in primary hepatocytes［J］.J Viro1，1999，73（4）：3162－3168.

［21］DANDRI M，BURDA M R，WILL H，et al.Increased hep-atocyte turnoxer and inhibition of woodchuck hepatitis B virus replication by adefo、ir in vitro do not lead to reduc-tion of the closed circular DNA［J］.Hepatology，2000，32 （1）：139－146.

［22］CHEN Y，SZE J，HE M L.HBV cccDNA in patientssera as an indicator for HBV reactivation and an early signal of 1iver damage［J］.World J Gastroentero1，2004，10（1）：82－85.

［責(zé)任編輯：朱穎?］

Application of ligase detection reaction（LDR）in detection of Lamivudine-resistant and Adefovir-resistant mutations

SHAN Youlan1，JIANG Peixue2
（1.Liver Disease Laboratory，Medical University，the Second Affiliated Hospital of Chongqing，Chongqing 400038，China；2.Department of Infectious Diseases，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200233，China）

Aim：To investigate the feasibility of LDR（ligase detection reaction）as a technique to de-tect HBV Lamivudine-resistant and Adefovir-resistant mutations.Methods：LDR and PCR techniques were used to detect the mutations in the region of hepatitis B virus gene with primers and probes.Re-sults：This method can well distinguish between wild-type and mutant plasmid vectors，and the sequen-cing results were well in agreement with LDR test results for the clinical samples of 90 cases.Conclu-sion：LDR method can be applied in the detection of Lamivudine-resistant hepatitis B virus and Adefovir resistance for clinical samples.

hepatitis B virus；Lamivudine；Adefovir；resistance mutations

R446.9

A

1000－9965（2015）06－0509－06

10.11778/j.jdxb.2015.06.012

2015－06－30

上?？莆瘎?chuàng)新發(fā)展基金項(xiàng)目（11DZ1920403）

單幼蘭（1967－）女，研究方向：傳染病的臨床分子診斷

江培學(xué)，男，復(fù)旦大學(xué)博士，Tel：021－60765836；E－mail：jiangpeixue＠126.com