補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在大鼠和人肝微粒體的酶促動(dòng)力學(xué)

陽(yáng)海鷹，鐘玉環(huán)，陳　琳，李　樺，莊笑梅（抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850）

補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在大鼠和人肝微粒體的酶促動(dòng)力學(xué)

陽(yáng)海鷹，鐘玉環(huán)，陳琳，李樺，莊笑梅
（抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850）

目的 研究中藥有效成分補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的細(xì)胞色素P450（CYP）酶促動(dòng)力學(xué)特征，比較其結(jié)構(gòu)和種屬差異，為體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征的預(yù)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。方法 建立補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測(cè)方法，在優(yōu)化人和大鼠肝微粒體孵育體系和評(píng)價(jià)體外代謝穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了代謝穩(wěn)定性和酶促動(dòng)力學(xué)研究，應(yīng)用非線(xiàn)性回歸法計(jì)算最大反應(yīng)速率（Vmax）和米氏常數(shù)（Km）。結(jié)果 應(yīng)用建立的LC-MS/MS檢測(cè)方法，補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素在肝微粒體孵育液中定量范圍為0.1～50.0 μmol·L-1，線(xiàn)性關(guān)系良好，精密度和準(zhǔn)確度等滿(mǎn)足檢測(cè)要求。體外代謝穩(wěn)定性研究顯示，當(dāng)?shù)孜餄舛葹? μmol·L-1，蛋白濃度為0.5 g·L-1，孵育40 min內(nèi)，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素在大鼠和人肝微粒體呈線(xiàn)性消除，體外半衰期分別為74.5，95.0，74.5和173.3 min。補(bǔ)骨脂素在大鼠和人肝微粒體中的Vmax分別為：（1.140± 0.080）μmol·min-1·g-1蛋白，（0.620±0.060）μmol·min-1·g-1蛋白；Km分別為（12.9±0.3）μmol·L-1和（7.4±1.3）μmol·L-1。異補(bǔ)骨脂素在大鼠和人肝微粒體中的Vmax分別為（0.251±0.012）μmol·min-1·g-1蛋白和（0.103± 0.014）μmol·min-1·g-1蛋白；Km分別為：（3.0±0.4）μmol·L-1和（3.4±0.7）μmol·L-1。結(jié)論 補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素的CYP酶促動(dòng)力學(xué)特征及代謝穩(wěn)定性具有一定的種屬和結(jié)構(gòu)差異，在大鼠兩者基于CYP酶的代謝清除過(guò)程可能相似。而在人體，異補(bǔ)骨脂素的CYP代謝清除可能慢于補(bǔ)骨脂素，導(dǎo)致藥代動(dòng)力學(xué)特征的差異。

補(bǔ)骨脂素；異補(bǔ)骨脂素；肝微粒體；細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)；藥代動(dòng)力學(xué)

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2015.06.008

中藥補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia L.）的果實(shí)，性溫，味辛，具補(bǔ)腎助陽(yáng)之功效。補(bǔ)骨脂素（psoralen，PRN）和異補(bǔ)骨脂素（isopsoralen，IPRN）是補(bǔ)骨脂的主要有效成分，具有抗腫瘤、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抗過(guò)敏等功效［1］。PRN 和IPRN還是多種中藥制劑中的重要組成成分，主要的臨床應(yīng)用是治療白癜風(fēng)、銀屑病等皮膚頑疾?？诜RN加紫外線(xiàn)照射的光化學(xué)療法自1974年首次報(bào)告有效治療銀屑病以來(lái)，已治愈大量患者，1982年美國(guó)FDA批準(zhǔn)臨床應(yīng)用該法治療銀屑?。?］。

PRN和IPRN屬于呋喃香豆素類(lèi)化合物，其代謝主要包括7-羥化、內(nèi)酯環(huán)開(kāi)環(huán)等途徑［3］。文獻(xiàn)報(bào)道，這類(lèi)化合物在體內(nèi)主要經(jīng)細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P-450，CYP）代謝并對(duì)CYP酶有抑制或誘導(dǎo)作用，應(yīng)用人肝微粒體和大鼠肝微粒體研究發(fā)現(xiàn)，PRN和IPRN對(duì)CYP1A2有較強(qiáng)的抑制作用［4］。因此，研究PRN和IPRN的代謝特征以及與CYP代謝酶的作用，對(duì)加深該有效成分藥理藥效本質(zhì)及作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)、指導(dǎo)臨床合理用藥有重要意義。本研究應(yīng)用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分別研究PRN和IPRN在人源和大鼠肝微粒體的CYP酶促動(dòng)力學(xué)特征，比較結(jié)構(gòu)和種屬差異的影響，為深入研究PRN和IPRN與CYP酶的相互作用以及體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征預(yù)測(cè)提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器

對(duì)照品PRN（純度99.9%，批號(hào)110739-201416）、IPRN（純度 99.9%，批號(hào) 102983-201423）（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1）和內(nèi)標(biāo)鹽酸普萘洛爾（純度＞99%，批號(hào)BCBB9359V）購(gòu)自中國(guó)藥品和生物制品檢定所；NADPH購(gòu)自瑞士Roche公司；甲醇和乙腈均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；水為娃哈哈飲用純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），其他試劑均為分析純。Agilent 6410 B液質(zhì)聯(lián)用儀和ZORBAX SB-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）為美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品。

Fig.1 Chemical structures of psoralen（PRN）（A）and isopsoralen（lPRN）（B）.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠20只，雄性，體質(zhì)量為180～220 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK-（軍）2011-0010。

1.3 肝微粒體來(lái)源或制備

50人混合肝微粒體（蛋白含量20 g·L-1，批號(hào)：34689）購(gòu)自美國(guó)BD Gentest公司。20只雄性SD大鼠混合肝微粒體為實(shí)驗(yàn)室自制（差速離心法）［5］，應(yīng)用BCA蛋白檢測(cè)方法測(cè)得蛋白含量10 g·L-1。

1.4 LC-MS/MS定量檢測(cè)PRN和lPRN

色譜條件：流動(dòng)相A為含有0.1%甲酸的甲酸銨5 mmol·L-1溶液，B為含有0.1%甲酸的乙腈。洗脫梯度程序?yàn)?.0～1.0 min（30%B），1.0～1.5 min （30%B～95%B），1.5～3.5 min（95%B），3.5～4.0 min （95%B～30%B），平衡時(shí)間為4.0～4.5 min（30%B），運(yùn)行時(shí)間為4.5 min，流速為0.3 mL·min-1，柱溫25℃。內(nèi)標(biāo)為鹽酸普奈洛爾100 μg·L-1。

質(zhì)譜條件：ESI源正離子MRM方式檢測(cè)，毛細(xì)管溫度300℃，毛細(xì)管電壓4000 V，PRN和IPRN的檢測(cè)離子對(duì)質(zhì)荷比為186.7→131.1，碰撞能量為22 V，內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)離子對(duì)質(zhì)荷比為260→116.2，碰撞能量為14 V，PRN和IPRN的MS2質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。

1.5 PRN和lPRN的肝微粒體溫孵和代謝穩(wěn)定性

肝微粒體體外溫孵條件依照本研究室既往報(bào)道方法［6］。用磷酸鹽緩沖液100 mmol·L-1（K2HPO40.5 mmol·L-1/KH2PO40.5 mmol·L-1，pH=7.4）配置不同濃度的PRN和IPRN溶液（0.5，1.0和5.0 μmol·L-1），加入不同蛋白濃度肝微粒體溶液（0.2，0.5和1.0 g·L-1），與NADPH輔酶液（終濃度1 mmol·L-1）于37℃ 同時(shí)預(yù)孵育5 min后，將NADPH輔酶液加入含藥的肝微粒體溶液中啟動(dòng)反應(yīng)，繼續(xù)孵育一定時(shí)間（5，10，20，30，40和60 min）后，將終體積為200 μL的孵育樣品移至冰上，加入400 μL含內(nèi)標(biāo)（100 μg·L-1）的甲醇-乙腈（1∶1）終止反應(yīng)，渦旋30 s，離心（13 800×g，4℃）10 min，取上清10 μL進(jìn)樣分析?？疾觳煌跤龝r(shí)間、肝微粒體蛋白濃度和底物濃度對(duì)PRN和IPRN代謝穩(wěn)定性的影響，參考有關(guān)原則優(yōu)化溫孵條件［6］。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇0.5 g·L-1的肝微粒體蛋白含量，1 μmol·L-1的PRN和IPRN，37℃溫孵不同時(shí)間（0，5，10，20，40和60 min），計(jì)算代謝穩(wěn)定性。

Fig.2 Mass spectra of PRN（A）and lPRN（B）.

1.6 PRN和lPRN在大鼠和人肝微粒體的酶促動(dòng)力學(xué)特征

根據(jù)代謝穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，系列濃度PRN （0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，20.0和50.0 μmol·L-1）和 IPRN（0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，20.0和50.0 μmol·L-1）分別在0.5 g·L-1大鼠肝微粒體中孵育20 min，相同系列濃度的PRN在0.5 g·L-1的人肝微粒體中孵育20 min、IPRN在0.5 g·L-1的人肝微粒體中孵育40 min后，將終體積為200 μL的孵育樣品移至冰上，并加入400 μL含內(nèi)標(biāo)的甲醇-乙腈（1∶1）終止反應(yīng)，渦旋，離心（13 800×g，4℃）10 min，取上清10 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定PRN和IPRN的含量，計(jì)算代謝速率變化，每個(gè)濃度3個(gè)平行樣品。

用滅活后的空白人或大鼠肝微粒體溶液（0.5 g·L-1）配制0.1，0.5，2.0，10.0，20.0和50.0 μmol·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各200 μL，加入400 μL含內(nèi)標(biāo)（100 μg·L-1）的甲醇-乙腈（1∶1），渦旋30 s，離心（13 800×g，4℃）10 min，取上清10 μL進(jìn)樣分析，測(cè)定PRN和IPRN的含量。質(zhì)控樣品濃度分別為0.2，5.0和40.0 μmol·L-1，用與系列標(biāo)準(zhǔn)溶液相同方法處理，連續(xù)3 d，每日測(cè)定各濃度的3個(gè)平行樣品，得到日內(nèi)和日間精密度。為了考察回收率和基質(zhì)效應(yīng)，配制含0.2，5.0和40.0 μmol·L-13個(gè)濃度的人或大鼠肝微粒體溶液樣品，用與系列標(biāo)準(zhǔn)溶液相同方法處理為樣品Ⅰ；將空白樣品同樣方法處理后再加標(biāo)準(zhǔn)溶液，為樣品Ⅱ；另取標(biāo)準(zhǔn)溶液，為樣品Ⅲ。以同濃度樣品I的峰面積與樣品Ⅱ的峰面積之比，計(jì)算回收率；以同濃度樣品Ⅱ的峰面積與樣品Ⅲ的峰面積之比，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

體外代謝穩(wěn)定性：以0時(shí)的PRN和IPRN濃度作為100%，其他時(shí)間點(diǎn)的濃度與0時(shí)的濃度相比得到其剩余百分比。將各時(shí)間點(diǎn)剩余百分比的自然對(duì)數(shù)與相應(yīng)的孵育時(shí)間作圖，經(jīng)直線(xiàn)回歸求得斜率（-k），由式（1）得到兩藥在人和大鼠肝微粒體中的體外代謝半衰期（t1/2）。

酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算：應(yīng)用GraphPad Prism version 5.0（GraphPad Software Inc.，La Jolla， CA，USA）軟件中的非線(xiàn)性回歸分析方法計(jì)算PRN和IPRN在大鼠和人肝微粒體酶中代謝降解的米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax），內(nèi)在清除率Clint=Vmax/Km，實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)均用±s表示。

2 結(jié)果

2.1 PRN和lPRN定量檢測(cè)方法確證

如圖3所示，PRN、IPRN和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品色譜峰在大鼠肝微粒體孵育液中的保留時(shí)間分別為0.93，0.92和0.76 min，在分析物出峰區(qū)域，未見(jiàn)內(nèi)源性物質(zhì)干擾。在0.1～50.0 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，PRN 和IPRN的線(xiàn)性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程分別為：y=0.1127x+0.0235（r2=0.990）和y=0.0867x+0.0045 （r2=0.995）。0.2，5.0和40.0 μmol·L-1質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間精密度在3.8%和10.9%以?xún)?nèi)。PRN和IPRN的準(zhǔn)確度在92%～113%和101%～109%之間，回收率分別為98%～110%和95%～117%，基質(zhì)效應(yīng)在為98%～114%和90%～110%之間，均滿(mǎn)足檢測(cè)要求。

Fig.3 MRM chromatograms of PRN（C），lPRN（D）and internal standard（lS）in rat liver microsomal（RLM）incubations.A，B：blank RLM.1：propranolol hydrochloride（IS）；2：PRN；3：IPRN.The analysis of PRN，IPRN and IS was performed on an Agilent 6410 B LC-MS/MS，with a ZORBAX SB-C18column（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）.The mobile phase was water （containing 5 mmol·L-1ammonium formate and 0.1%formic acid）and acetonitrile（containing 0.1%formic acid）running with the gradient elution.The flow rate was 0.3 mL·min-1.The transition ions m/z 186.7→131.1 and m/z 260→116.2 were selected for the quantification of PRN，IPRN and IS，respectively.

應(yīng)用人肝微粒體孵育液進(jìn)行部分驗(yàn)證的結(jié)果表明，PRN和IPRN在人肝微粒體中孵育液的基質(zhì)效應(yīng)與大鼠微粒體孵育液相似，在97%～116%和91.7%～102%之間，線(xiàn)性范圍、精密度和準(zhǔn)確度均符合檢測(cè)要求。

2.2 PRN和lPRN在大鼠和人肝微粒體中代謝穩(wěn)定性

將不同濃度的PRN和IPRN與不同蛋白濃度的肝微粒體溫孵不同時(shí)間后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孜餄舛仍? μmol·L-1以?xún)?nèi)、蛋白含量0.5 g·L-1，以及孵育時(shí)間在40 min內(nèi)，兩藥呈線(xiàn)性消除。兩者的體外肝微粒體代謝穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)圖4。由公式（1）計(jì)算得到PRN在大鼠和人肝微粒體的t1/2分別為74.5和95.0 min，IPRN的t1/2分別為74.5和173.3 min。由體外代謝穩(wěn)定性的時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)可見(jiàn)，PRN在大鼠和人肝微粒體中孵育20 min時(shí)，原型藥物代謝消除約20%。IPRN在大鼠肝微粒體中孵育20 min、人肝微粒體中孵育40 min后，原型藥物的代謝消除約為20%，以此確定酶動(dòng)力學(xué)研究的孵育時(shí)間。

Fig.4 In vitro percentage of substrate remainingtime curves of PRN and lPRN in human or rat liver microsomes（HLM or RLM）.1 μmol·L-1PRN and IPRN solutions were mixed with liver microsomes at the protein content of 0.5 g·L-1.The mixtures were added with NADPH 1 mmol·L-1after being pre-warmed at 37°C for 5 min to reach the final volume of 200 μL.After 5，10，20，30，40 and 60 min incubation at 37°C，the reactions were stopped by addition of 400 μL methanolacetonitrile（1∶1）containing 100 μg·L-1IS.After vortexing for 30 s，the sample was centrifuged at 13 800×g for 10 min （4℃）.A 10 μL aliquot of the supernatant was analyzed by LC-MS/MS.±s，n=3.

2.3 PRN和lPRN在大鼠和人肝微粒體中酶促動(dòng)力學(xué)比較

應(yīng)用Eadie-Hofstee作圖法處理數(shù)據(jù)可見(jiàn)，4組酶促動(dòng)力學(xué)都未顯示明顯的雙相動(dòng)力學(xué)特征，初步判斷主要是單酶介導(dǎo)的肝代謝。應(yīng)用非線(xiàn)性回歸分析方法擬合PRN和IPRN在人和大鼠肝微粒體中酶促動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)見(jiàn)圖5，參數(shù)見(jiàn)表1。從結(jié)果可見(jiàn)，PRN對(duì)大鼠和人肝CYP酶的Km和Vmax均有明顯的種屬差異，但是Clint沒(méi)有明顯差異。IPRN對(duì)大鼠和人肝CYP酶的Km相似，Vmax有明顯的差異，因而Clint也表現(xiàn)出明顯差異；比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，IPRN在人肝微粒體的Clint明顯低于其他3組，PRN在大鼠和人肝微粒體以及IPRN在大鼠肝微粒體中的Clint相似。

Fig.5 Reaction rate-substrate concentration curves of PRN（A，B）and lPRN（C，D）in HLM（B，D）or RLM（A，C）. See Fig.4 for the incubation system and procedure.PRN（0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，20.0 and 50.0 μmol·L-1）and IPRN（0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，20.0 and 50.0 μmol·L-1），were incubated with RLM or HLM for 20 min，IPRN with HLM for 40 min.RLM and HLM were at the protein content of 0.5 g·L-1.±s，n=3.

Tab.1 Enzymatic kinetics parameters of PRN and lPRN in HLM or RLM

3 討論

藥物的CYP酶促動(dòng)力學(xué)特征是決定藥物代謝性質(zhì)的重要參數(shù)，也是評(píng)價(jià)藥物相互作用潛能的基礎(chǔ)［7］。早在30年前，美國(guó)制藥工業(yè)界就試圖根據(jù)藥物在肝微粒體中的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行體內(nèi)代謝動(dòng)力學(xué)的預(yù)測(cè)［8］。由于酶促動(dòng)力學(xué)研究方法比較成熟，并可應(yīng)用人源材料（人肝微粒體）通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)獲得酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)（Km和Vmax），因此可快速在人體試驗(yàn)前用最低成本獲得肝清除率等重要性質(zhì)，對(duì)新藥研發(fā)具有重要意義［9］。

本研究首先進(jìn)行了體外代謝穩(wěn)定性評(píng)價(jià)，了解兩藥的體外肝代謝消除性質(zhì)，并優(yōu)化肝微粒體蛋白濃度、底物濃度和孵育時(shí)間等孵育條件。比較兩藥的大鼠和人肝微粒體的代謝穩(wěn)定性曲線(xiàn)可見(jiàn)，PRN 和IPRN在大鼠微粒體以及PRN在人肝微粒體的消除曲線(xiàn)相似，而IPRN在人肝微粒體的消除曲線(xiàn)較為平緩，明顯慢于前3組，此結(jié)果與酶促動(dòng)力學(xué)研究中獲得的體外清除率相符。

酶促動(dòng)力學(xué)研究主要有兩種方法，底物消除法和產(chǎn)物生成法，雖然產(chǎn)物生成法是比較準(zhǔn)確測(cè)定酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法，但必須獲得藥物代謝轉(zhuǎn)化數(shù)據(jù)以及產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品。相比之下，底物消除法更適用于化合物研究的早期。Youdim等［10］研究發(fā)現(xiàn)，兩種方法獲得的結(jié)果除了個(gè)別藥物代謝通路復(fù)雜，會(huì)產(chǎn)生3倍的偏差外，其他大部分化合物的Km值都不會(huì)有太大的差異。因此，本研究在缺乏代謝產(chǎn)物鑒定和標(biāo)準(zhǔn)品的基礎(chǔ)上采用了原型藥物消除法進(jìn)行酶促動(dòng)力學(xué)研究。

在酶促動(dòng)力學(xué)研究中獲得的Km和Vmax參數(shù)值，除了定義藥物的酶促反應(yīng)性質(zhì)外，還可為藥物體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征的預(yù)測(cè)提供重要信息。例如，當(dāng)體內(nèi)藥物濃度遠(yuǎn)低于Km時(shí)，代謝清除通常是線(xiàn)性的，此時(shí)清除率Cl約為Vmax/Km；當(dāng)體內(nèi)藥物濃度高于Km時(shí)，藥物的體內(nèi)清除將逐漸超過(guò)酶的代謝能力，呈現(xiàn)非線(xiàn)性過(guò)程。由本研究的數(shù)據(jù)可見(jiàn)，PRN和IPRN在人肝微粒體中的Km分別為7.4和3.4μmol·L-1，口服含有這兩種成分的中藥后，吸收入血的濃度很可能低于該水平，藥物將以線(xiàn)性速率消除。但是，當(dāng)多種藥物合并使用，PRN和IPRN的代謝受到抑制時(shí)，血藥濃度可能大幅增加，應(yīng)注意可能出現(xiàn)的非線(xiàn)性藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程。此外，根據(jù)體外內(nèi)在清除率推算肝清除率，可初步判斷肝代謝清除作用對(duì)藥物體內(nèi)總清除及生物利用度的貢獻(xiàn)。從本研究中獲得的內(nèi)在清除率推算其相應(yīng)的肝清除率，并與大鼠和人的生理肝血流量（Qhrat=55.2 mL·min-1·kg-1，Qhhuman=20.7 mL·min-1·kg-1）［11］相比后發(fā)現(xiàn)，PRN和IPRN在人肝的抽提率分別約為80%和60%；而兩者在大鼠肝的抽提率相似約為60%，兩者的生物利用度均可能＜40%。

代謝酶存在的種屬差異，是動(dòng)物結(jié)果難以直接外推到人的主要因素［12］。本研究系統(tǒng)比較了兩個(gè)化合物在大鼠和人肝微粒體中的代謝穩(wěn)定性及酶促動(dòng)力學(xué)特征。結(jié)果顯示，PRN在人肝微粒體CYP酶的Km顯著高于大鼠，Vmax低于大鼠，而線(xiàn)性清除率在兩個(gè)種屬間相似。IPRN與人和大鼠肝CYP酶的Km相當(dāng)，但Vmax有明顯差別，因此Clint也有明顯差別，在人肝微粒體中Clint顯著低于大鼠。結(jié)果分析表明，兩個(gè)化合物在人和大鼠肝微粒體的酶促動(dòng)力學(xué)性質(zhì)存在種屬差異，在應(yīng)用動(dòng)物體外結(jié)果進(jìn)行人體外推時(shí)，需要注意。

PRN和IPRN是同分異構(gòu)體，在結(jié)構(gòu)上分別屬于線(xiàn)性和角型兩類(lèi)天然呋喃香豆素化合物［13］。由目前研究可見(jiàn)，兩者在人和大鼠肝微粒體中，酶促動(dòng)力學(xué)特征均有差別，特別是在人肝微粒體，PRN的代謝清除要明顯快于IPRN，提示二者在化學(xué)結(jié)構(gòu)上的差異，可能導(dǎo)致其與酶的活性位點(diǎn)結(jié)合特性和親和力的差異，有必要在動(dòng)物和人體代謝研究中進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述，PRN和IPRN在體外大鼠和人肝微粒體孵育體系中的代謝清除呈現(xiàn)明顯的種屬和結(jié)構(gòu)差異。這些結(jié)果為深入研究PRN和IPRN與CYP酶的相互作用，以及應(yīng)用體外結(jié)果對(duì)體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征的預(yù)測(cè)和解釋提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

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（本文編輯：沈海南 齊春會(huì)）

Enzyme kinetics of psoralen and isopsoralen in rat and human liver microsomes

YANG Hai-ying，ZHONG Yu-huan，CHEN Lin，LI Hua，ZHUANG Xiao-mei
（State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures，Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTlVE To investigate and compare the enzyme kinetic characters of psoralen （PRN）and isopsoralen（IPRN）in rat and human liver microsomes.METHODS PRN and IPRN in liver microsomes incubates were determined using LC-MS/MS.The enzyme kinetic and metabolic stability ofPRN and IPRN were investigated by employing the optimized rat and human liver microsomes incubations. The Vmaxand Kmvalues were calculated using the nonlinear regression method.RESULTS The quantitative method showed good linearity within the range of 0.1-50.0 μmol·L-1and was suitable for the assay in biological samples.The in vitro elimination was linear with the substrate concentrations lower than 1 μmol，the protein concentration within 0.5 g·L-1，and the incubation time within 40 min.The t1/2values of PRN and IPRN in rat and human liver microsomes were 74.5，95.0，74.5 and 173.3 min，respectively.The Vmaxvalues of PRN in rat and human liver microsomes were（1.140±0.080）μmol·min-1·g-1protein，（0.620±0.060）μmol·min-1·g-1protein，while Kmvalues of PRN in rat and human liver microsomes were（12.9±0.3）μmol·L-1，（7.4±1.3）μmol·L-1，respectively.The Vmaxvalues of IPRN in rat and human liver microsomes were（0.251±0.012）and（0.103±0.014）μmol·min-1·g-1protein，while Kmvalues of IPRN in rat and human liver microsomes were（3.0±0.4）μmol·L-1，（3.4±0.7）μmol·L-1，respectively. CONCLUSlON The enzyme kinetic characters and metabolic stability of PRN and IPRN show species and chemical structures related differences.Interestingly，the metabolic eliminations of PRN and IPRN are similar in rats.However，the metabolic elimination of IPRN in humans involved in CYP enzymes may be much slower than that of PRN.

psoralen；isopsoralen；liver microsomes；cytochrome P-450 enzyme system；pharmacokinetics

The project supported by National Science and Technology Major Project（2012ZX09301003-001-009）；National Science and Technology Major Project（2013ZX09J13103-01B）；National Science and Technology Major Project（2014ZX09507001003）；and National Science and Technology Major Project（2014ZX09J14103-01A）

ZHUANG Xiao-mei，E-mail：xiaomeizhuang@163.com，Tel：（010）66930665

R969.1，R285.5

A

1000-3002（2015）06-0924-07

國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2012ZX09301003-001-009）；國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2013ZX09J13103-01B）；國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2014ZX09507001003）；國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2014ZX09J14103-01A）

陽(yáng)海鷹，女，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事藥物代謝研究。

莊笑梅，E-mail：xiaomeizhuang@163.com，Tel：（010）66930665

（2015-03-24接受日期：2015-11-09）