亳州產(chǎn)丹參藥材UPLC-MS指紋圖譜研究*

王　洋，石　喆，陳　濤，李　正，崔維利，李　進(jìn)（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

亳州產(chǎn)丹參藥材UPLC-MS指紋圖譜研究*

王洋，石喆，陳濤，李正，崔維利，李進(jìn)
（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

［目的］研究和建立亳州產(chǎn)丹參藥材的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（U PL C-M S）指紋圖譜，考察不同批次丹參藥材的質(zhì)量穩(wěn)定性，為全面的評(píng)價(jià)其整體質(zhì)量提供依據(jù)。［方法］采用U PL C-M S法分別對(duì)水溶性成分和脂溶性成分進(jìn)行測(cè)定，對(duì)10批樣品的相似度進(jìn)行計(jì)算分析；對(duì)共有峰進(jìn)行標(biāo)定，并通過(guò)M S數(shù)據(jù)對(duì)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。［結(jié)果］建立了10批亳州產(chǎn)丹參藥材中水溶性成分和脂溶性成分的U PL C-M S指紋圖譜，標(biāo)定共有峰18個(gè)，其中水溶性成分8個(gè)，脂溶性成分10個(gè)，鑒定了其中9個(gè)色譜峰的化學(xué)成分，10批樣品的相似度均大于0.90。［結(jié)論］該方法準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，可以用于丹參藥材的整體質(zhì)量評(píng)價(jià)。

丹參藥材；液質(zhì)聯(lián)用；指紋圖譜；質(zhì)量控制

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.07.14

丹參為唇形科植物丹參（Salviamiltiorrhiza Bge.）的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消痛的功效［1］。丹參中主要包括水溶性的丹參酚酸類(lèi)和脂溶性的丹參酮類(lèi)成分［2］?，F(xiàn)代研究表明，丹參具有多種藥理作用，特別是在治療心腦血管疾病時(shí)［3-7］，其時(shí)常作為原料藥單一使用或與其他藥物配伍組成復(fù)方使用［8-13］。丹芪偏癱膠囊為國(guó)家中藥6類(lèi)新藥，由丹參、黃芪、赤芍等14味藥物組成，主要用于腦梗死的恢復(fù)期［14-15］，丹參為其中君藥，主要有效成分既有酚酸類(lèi)成分，又包括脂溶性的丹參酮類(lèi)成分。

丹芪偏癱膠囊中丹參的產(chǎn)地已固定為安徽亳州，目前丹參藥材的企業(yè)質(zhì)量控制方法為2010版《中國(guó)藥典》，采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)藥材中丹酚酸B和丹參酮IIA進(jìn)行含量測(cè)定。而中藥作為復(fù)雜混合體系，其成分組成復(fù)雜，僅以其中的某幾個(gè)成分為指標(biāo)很難全面的表征其化學(xué)特征和控制整體質(zhì)量。指紋圖譜技術(shù)可以對(duì)中藥中的化學(xué)成分進(jìn)行全方位的表征，這正好與中醫(yī)強(qiáng)調(diào)的整體觀念相吻合［16］。本研究采用快速、高效且定性準(zhǔn)確的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS），建立了10批安徽亳州產(chǎn)丹參藥材的指紋圖譜，對(duì)丹參中水溶性及脂溶性成分進(jìn)行了全面分析，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)其中主要的指紋峰進(jìn)行了指認(rèn)，并通過(guò)相似度計(jì)算對(duì)樣品進(jìn)行了評(píng)價(jià)，為制定丹芪偏癱膠囊中丹參藥材的全面質(zhì)量控制方法提供了科學(xué)依據(jù)。

1　儀器與試藥

Acquity UPLC I-class超高效液相色譜儀、XEVOTQD三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀、電噴霧離子化源（ESI）、MassLynx數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；AG135電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ300DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

對(duì)照品丹酚酸B（批號(hào)111562-200504）、丹參素鈉（批號(hào)110855-200809）、隱丹參酮（批號(hào)852-9903）、丹參酮Ⅰ（批號(hào)0867-200104）、丹參酮ⅡA（批號(hào)110766-200417）、迷迭香酸（批號(hào)111871-201001）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；紫草酸（批號(hào)20131203）購(gòu)自上海永恒生物科技有限公司；丹酚酸A（批號(hào)MUST-13020701）、二氫丹參酮Ⅰ（批號(hào)MUST-13082317）購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；上述標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。試劑甲醇（德國(guó)Merck公司）、甲酸（美國(guó)Tedia公司）均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為自制超純水。丹參藥材由天津市石天藥業(yè)有限責(zé)任公司提供（均采自安徽省亳州市），由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院李進(jìn)主任藥師鑒定，為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根莖。丹參藥材的具體產(chǎn)地見(jiàn)表1。

圖1　 9種丹參成分的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structuresofnine chem ical constituents in Danshen

表1　安徽亳州不同地區(qū)產(chǎn)丹參藥材Tab.1 Danshens’origin in AnhuiBozhou from different habitats

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：ACQUITYUPLC?HSST3（2.1mm×100mm，1.7μm）。流動(dòng)相：0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫，脂溶性成分：0～2min，25%～30%B；2～3min，30%～50%B；3～5 min，50%～60%B；5～10min，60%～70%B；10～15min，70%～80% B；15～16min，80%～25%B；16～18min，25%B；水溶性成份：0～3min，10%～19%B；3～7min，19%～23%B；7～9min，23%～30%B；9～11min，30%B；11～12min，30%～10%B；12～15min，10%B。流速：0.4mL/min；樣品室溫度：20℃；進(jìn)樣體積：5μL；柱溫：水溶性成分30℃，脂溶性成分40℃。

2.2質(zhì)譜條件電離源：ESI，水溶性成分負(fù)離子掃描，脂溶性成分正離子掃描。脫溶劑溫度：400℃，脫溶劑氣體流量：700 L/h，錐孔電壓：50 V，錐孔氣流量：50 L/h，毛細(xì)管電壓：3 kV，離子源溫度：150℃，質(zhì)量掃描范圍：m/z100～1000。

2.3溶液制備

2.3.1對(duì)照品溶液的制備分別取丹酚酸B、丹參素鈉、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸A適量，精密稱(chēng)定，加50%甲醇分別制成約100μg/mL的對(duì)照品溶液；分別取二氫丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA適量，精密稱(chēng)定，加甲醇分別制成約100μg/mL的對(duì)照品溶液，即得。

2.3.2供試品溶液的制備取丹參藥材，粉碎，過(guò)2號(hào)篩，精密稱(chēng)定1.0g，置具塞三角瓶中，加入甲醇50mL，超聲40min，過(guò)濾，蒸干，用甲醇溶解殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至50mL量瓶中，加甲醇稀釋至50mL，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得脂溶性成分供試品溶液。取甲醇超聲濾過(guò)后的藥粉殘?jiān)?，加?0%甲醇50mL，超聲40min，過(guò)濾，蒸干，用50%甲醇溶解殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至50mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至50mL，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得水溶性成分供試品溶液。

2.4指紋圖譜方法學(xué)考察

2.4.1精密度實(shí)驗(yàn)取樣品S1 1份，按“2.3.2”項(xiàng)下

方法制備丹參水溶性及脂溶性成分供試品溶液，精密量取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察儀器的精密度。結(jié)果表明，色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.0%，峰面積的RSD均小于3.0%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.4.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取樣品S1 6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法平行制備丹參水溶性及脂溶性成分供試品溶液各6份，考察方法的重復(fù)性。結(jié)果表明，色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于2.0%，峰面積的RSD均小于3.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取樣品S1 1份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備丹參水溶性及脂溶性成分供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣檢測(cè)，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于1.5%，峰面積的RSD均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定［17-19］。

2.5指紋圖譜的建立與共有峰的確定按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備10批次的丹參水溶性及脂溶性成分供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件及“2.2”項(xiàng)質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，建立丹參藥材中水溶性成分及脂溶性成分的UPLC-MS總離子流色譜指紋圖譜，如圖2所示。將上述10批次藥材的結(jié)果導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004A版），對(duì)亳州產(chǎn)丹參藥材的水溶性成分及脂溶性成分的UPLC-MS總離子流色譜圖譜進(jìn)行匹配。標(biāo)定匹配數(shù)目為10的色譜峰為共有峰，其中水溶性成分8個(gè)，脂溶性成分10個(gè)，且共有峰的總面積占總峰面積的90%以上。2.6指紋圖譜相似度計(jì)算采用國(guó)家藥典委員會(huì)頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004A版）進(jìn)行相似度計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。10批丹參藥材的水溶性成分和脂溶性成分的相似度結(jié)果均大于0.90。說(shuō)明10個(gè)批次丹參藥材的化學(xué)輪廓比較接近，成分比較穩(wěn)定。

表2　 10批藥材水溶性成分指紋圖譜相似度Tab.2 Fingerprrint sim ilarity ofphenolic acids inn 10 batch herbs

圖2　典型的丹參藥材UPLC-MS總離子流色譜指紋圖譜（S1）Fig.2 TypicalUPLC-MS total ionic chromatographic fingerp rintsof Danshen（S1）

表3　 10批藥材脂溶性成分指紋圖譜相似度Tab.3 Fingerprrint sim ilarity of tanshinones in 10 batchesherbs

2.7指紋圖譜色譜峰的確認(rèn)采用對(duì)照品對(duì)指紋圖譜中的色譜峰進(jìn)行確認(rèn)。按“2.1”項(xiàng)色譜條件及“2.2”項(xiàng)質(zhì)譜條件，分別進(jìn)樣供試品溶液、對(duì)照品溶液，通過(guò)保留時(shí)間和質(zhì)譜信息，確認(rèn)色譜峰，結(jié)果見(jiàn)圖2。

3　討論

本研究通過(guò)采用UPLC-MS技術(shù)建立了安徽亳州產(chǎn)丹參藥材的總離子流色譜指紋圖譜。通過(guò)連續(xù)提取制備供試品溶液，主要考慮與丹芪偏癱膠囊的制備工藝保持一致，以便能最大限度的反應(yīng)藥材的化學(xué)指紋特性。選擇質(zhì)譜作為樣品測(cè)定的檢測(cè)器，可以有效地克服紫外檢測(cè)器的局限性以及蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的不穩(wěn)定性，并且其具有更加準(zhǔn)確的定性能力。在色譜條件的建立時(shí)考察了BEH及HSS T3兩種型號(hào)的色譜柱，結(jié)果表明對(duì)于極性較大的丹參水溶性成分，HSST3具有更好的保留特點(diǎn)和更多的色譜峰數(shù)目。在流動(dòng)相的選擇上，分別考察了甲醇、乙腈、甲酸、乙酸等溶液的組合，兼顧考慮分離及化合物的電離效果，確定以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈溶液系統(tǒng)梯度洗脫效果最佳。質(zhì)譜條件的優(yōu)化主要是考慮主要化合物的響應(yīng)情況，由于酚酸類(lèi)化合物易產(chǎn)生［M-H］-離子，而丹參酮類(lèi)化合物易產(chǎn)生［M+H］+離子，所以選擇負(fù)離子模式對(duì)水溶性成分進(jìn)行掃描，選擇正離子模式對(duì)脂溶性成分進(jìn)行掃描。通過(guò)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量掃描范圍為m/z100～1 000可以有效地滿足丹參藥材中小分子有機(jī)化合物的分析要求。在此基礎(chǔ)上，再通過(guò)優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓等質(zhì)譜工作參數(shù)，使供試品獲得最大的離子響應(yīng)。

中藥指紋圖譜可以全面的反應(yīng)其整體化學(xué)信息，避免單一組分的局限性。本研究建立了丹芪偏癱膠囊中君藥丹參中水溶性及脂溶性成分的UPLC-MS總離子流色譜指紋圖譜，共計(jì)標(biāo)定共有峰18個(gè)，明確了其中9個(gè)色譜峰的成分。該方法準(zhǔn)確可靠、重現(xiàn)性好，可以有效地控制丹參藥材的整體質(zhì)量。為從源頭上保證丹芪偏癱膠囊質(zhì)量的穩(wěn)定性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯：高杉，滕曉東）

UPLC-M S fingerprint of Salviam iltiorrhiza Bge.in Bozhou

WANGYang，SHIZhe，CHEN Tao，LIZheng，CUIWei-li，LIJin
（The FirstA ffiliated Hospitalof Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study and establish the UPLC-MS fingerprintof Salviamiltiorrhiza Bge.（Danshen），to investigate the stability of differentbatchesof sample for comprehensive evaluation of the quality of Danshen.［M ethods］The fingerprintof Danshen（including water-soluble phenolic acids and lipophilic tanshinones）was applied to UPLC-MS，and the similarity of 10 batchesofsampleswas analyzed.The common peak was determ ined，and identified by the MSdata.［Results］The UPLC-MS fingerprintof Danshen wasobtained，and 18 common fingerprintpeakswere indicated（including8water-soluble phenolic acidsand 10 lipophilic tanshinones），and 9 of them were identified by comparison with reference standards，and the similarities of the 10 samplesweremore than 0.90.［Conclusion］The method is reliableand stable，which can beused for the comprehensiveevaluation ofDanshen.

Salviam iltiorrhiza Bge.；UPLC-MS；fingerprint；quality control

R284.2

A

1672-1519（2015）07-0437-05

天津市科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（06FZZDSH00 408）；天津市西青區(qū)科技創(chuàng)新專(zhuān)項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目（XQCXZX2012-006）；天津市西青區(qū)科技型中小企業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（XQKC 2013-022）。

王洋（1981-），男，博士，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴庴w內(nèi)外藥物分析和中藥藥理學(xué)。

李進(jìn)，E-mail:lijin@shitian.com。

（2015-02-25）