消巖湯劑拆方配伍對A549肺腺癌細(xì)胞體外生長抑制作用研究*

李小江，賈英杰，于建春，張小青，杜曉玲，朱津麗，孟　醒（.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，天津009；.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津0007；.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津009）

消巖湯劑拆方配伍對A549肺腺癌細(xì)胞體外生長抑制作用研究*

李小江1，賈英杰1，于建春1，張小青1，杜曉玲2，朱津麗1，孟醒3
（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，天津300193；2.南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300071；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

［目的］探討消巖湯及各拆方組對人肺腺癌A549細(xì)胞的體外生長的作用機(jī)制，探究消巖湯劑中最有效的作用成分和濃度。［方法］消巖湯全方和根據(jù)功效拆分的清熱解毒組、活血化瘀組、益氣扶正組，以CCK-8檢測A549肺腺癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性。［結(jié)果］各組均有明顯的抑制細(xì)胞活性作用，抑制強(qiáng)度依次為：全方組、清熱解毒組、活血化瘀組、益氣扶正組。［結(jié)論］消巖湯及其拆方組在體外實(shí)驗(yàn)中均能抑制A549肺腺癌細(xì)胞細(xì)胞生長，消巖湯全方組當(dāng)濃度達(dá)到50g/L時(shí)達(dá)到最大抑制率為85.60%。清熱解毒組藥物在抗腫瘤作用方面，與全方接近，提示清熱解毒組中藥為體外實(shí)驗(yàn)中全方抗腫瘤作用最有效組分。

消巖湯；肺腺癌A549細(xì)胞；體外抑制作用

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2015.07.11

消巖湯系天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科賈英杰教授治療惡性腫瘤之精方，基于腫瘤病機(jī)“正氣內(nèi)虛，毒瘀并存”，以“扶正固本，解毒祛瘀”為治法，結(jié)合多年臨證經(jīng)驗(yàn)總結(jié)擬成“消巖湯”。該方以黃芪、太子參共為君藥，滋陰益氣、扶正抗癌；以夏枯草、生牡蠣、白花蛇舌草配合使用，清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)，共為臣藥；佐以姜黃、郁金共奏行氣散結(jié)、活血祛瘀之功；全方具有解毒祛瘀，扶正抗癌之功效。諸藥合用，共奏益氣滋陰、活血祛瘀、清熱解毒、扶正驅(qū)邪之功［1-5］。本實(shí)驗(yàn)選用人肺腺癌A549細(xì)胞，通過全方及拆方研究，觀察消巖湯全方及其不同組分中藥對人肺腺癌A549細(xì)胞的影響，尋找消巖湯抑瘤作用的主要成分及最大抑制濃度。

1　材料

1.1藥物與試劑CCK-8試劑盒（武漢博士德生物有限公司）；RPMI-1640培養(yǎng)液（Gibco公司），小牛血（Amresco公司），青-鏈霉素（南京凱基生物科技公司）。消巖湯由黃芪、太子參、夏枯草、生牡蠣、白花蛇舌草、姜黃、郁金等中藥組成，由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供。根據(jù)功效將全方拆分為3組：清熱解毒組（夏枯草、生牡蠣、白花蛇舌草）；益氣扶正組（黃芪、太子參）；活血祛瘀組（姜黃、郁金）。中藥均購自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，中藥的濃縮液為棕黃色液體，劑量以原方為準(zhǔn)，由天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥提取室嚴(yán)格回流提取，其終濃度分別為含生藥2、1、1、1g/mL。

1.2細(xì)胞人肺腺癌細(xì)胞株A549，由南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

1.3儀器Bio-tek Synergy2多功能酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司），醫(yī)用凈化工作臺、二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)、倒置相差顯微鏡。

2　方法

2.1 A549肺腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)A549細(xì)胞置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于5%CO2培養(yǎng)箱，恒溫37℃培養(yǎng)。每2～3 d換液1次，使用0.05%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）常規(guī)消化傳代，4g/L臺盼藍(lán)染色后計(jì)算細(xì)胞數(shù)和活率（＞98%），取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2樣品的制備中藥消巖湯及各組拆方中藥10 000 r/min離心5min，取上清液用0.22μm過濾器除菌，用培養(yǎng)基稀釋成梯度濃度的溶液。

2.3 CCK-8法檢測消巖湯劑拆方配伍對腫瘤細(xì)胞生長的影響選取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化，調(diào)整細(xì)胞濃度至以每升5×107個(gè)接著于96孔板中，每孔80μL。待貼壁后，加入RPMI-1640、10%胎牛血清培養(yǎng)基同步化24 h。設(shè)立對照組（加含有CCK-8培養(yǎng)液）、實(shí)驗(yàn)組（加不同濃度藥物、含CCK-8培養(yǎng)液）、調(diào)零組（不同濃度含藥培養(yǎng)液）、陰性對照組（細(xì)胞懸液）。實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的中藥，4組中藥用培養(yǎng)基稀釋成梯度濃度的溶液（經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，消巖湯全方組、清熱解毒組、活血化瘀組、益氣扶正組以10、20、30、40、50、60、70、80、90g/L濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)），加入96孔板，200μL每孔，每個(gè)濃度重復(fù)6孔，培養(yǎng)48 h；48 h后，每個(gè)濃度取4孔加入20μLCCK-8溶液，37℃孵育4 h。在酶標(biāo)儀上（λ=450 nm）測各孔吸光度值（A值），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)以下公式計(jì)算藥物對細(xì)胞的生長抑制率（IC）。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以表示，用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組間比較采用方差分析。

3　結(jié)果

3.1消巖湯全方及各組藥物對人肺腺癌A549細(xì)胞作用后吸光度情況見圖1和表1、表2。

利用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件，以兩因素方差分析對不同濃度各藥物處理的細(xì)胞A值進(jìn)行分析，得出不同藥物A值有差異，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 232.394，P＜0.001），不同濃度的A值也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=220.890，P＜0.001）。進(jìn)一步利用LSD法對不同藥品間進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果見表1。

各組藥物均表現(xiàn)出對人肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用。隨著劑量的增加作用逐漸增強(qiáng)，達(dá)到峰值后逐漸減小。各組A值見圖1，數(shù)據(jù)結(jié)果見表2。

圖1　各組藥物體外對A 549細(xì)胞生長的A值Fig.1 A of eachgroup of decoction on A549 cells in vitrogrow th

由表2可以看出，各藥物組間均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中活血化瘀組最小，隨后依次為益氣扶正組和消巖湯組，清熱解毒組最大。

表1　各組藥物體外對A549細(xì)胞的A值兩兩比較Tab.1 A of eachgroup of decoction on A549 cells in vitrogrow th

表2　各組藥物體外對A549細(xì)胞生長的A值Tab.2 Comparison of different decoctionson A of eachgroup of decoction on A549 cells in vitrogrow th

表3　各組藥物體外對A549細(xì)胞生長的抑制率Tab.3 Inhibition rateof eachgroup ofdecoction on A549 cells in vitrogrow th %

圖2　各組藥物體外對A549細(xì)胞生長的抑制率Fig.2 Inhibition rateof eachgroup of decoction on A549 cells in vitrogrow th

3.2消巖湯全方及各組藥物對人肺腺癌A549細(xì)胞的抑制情況見表3、圖2。各組藥物均對人肺腺癌A549細(xì)胞有一定的抑制作用。其中消巖湯全方組當(dāng)濃度達(dá)到50g/L時(shí)達(dá)到最大抑制率85.60%；活血祛瘀組藥物濃度達(dá)到60g/L時(shí)達(dá)到最大抑制率82.47%；清熱解毒組藥物濃度達(dá)到70g/L時(shí)達(dá)到最大抑制率81.54%；益氣扶正組藥物濃度達(dá)到80g/L時(shí)達(dá)到最大抑制率85.85%。提示消巖湯劑拆方配伍對人肺腺癌A549細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用。

從抑制率看，其抑制強(qiáng)度順序依次為消巖湯全方組、清熱解毒組、活血化瘀組、益氣扶正組。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對其他拆方組，清熱解毒組作用最強(qiáng)，起效最快，抑制曲線與消巖湯全方組趨勢最接近，提示清熱解毒組中藥為全方體外抑抗腫瘤作用的重要組分；其次為活血化瘀藥物；益氣扶正組中藥次之。

4　討論

消巖湯是在“解毒祛瘀，扶正抗癌”中醫(yī)腫瘤治則基礎(chǔ)上依據(jù)現(xiàn)代藥理研究研制出的中藥制劑，具有多種抗腫瘤活性，在臨床應(yīng)用數(shù)十年。大量前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，“消巖湯”能有效改善腫瘤患者相關(guān)癥狀，提高患者生活質(zhì)量及免疫水平，延長生存期，對放療、化療具有“減毒增效”作用，并且能有效提高荷瘤小鼠的免疫功能，升高血清中瘦素受體水平、改善身體機(jī)能，抗腫瘤血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞生長，抑制腫瘤轉(zhuǎn)移［6-18］。

本研究證實(shí)消巖湯劑及其拆方組均對人肺腺癌A549細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，具有扶正抑瘤的功效。消巖湯全方組當(dāng)濃度達(dá)到50g/L時(shí)達(dá)到最大抑制率85.60%。其中清熱解毒組中藥為全方體外抑瘤作用的最重要組分，為中醫(yī)藥治療肺癌的臨床應(yīng)用提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯：馬英，滕曉東）

Study of the inhibition effectandmechanism of Xiaoyan decoction and decomposed recipeon A549 cells in vitro

LIXiao-jiang1，JIA Ying-jie1，YU Jian-chun1，ZHANGXiao-qing1，DU Xiao-ling2，Zhu Jin-li1，MENGXing3
（1.Oncology Department，The FirstAffiliated Hospitalof Tianjin University of TraditionalChineseMedicine，Tianjin 300193，China；2.The College of Life Sciences，NankaiUniversity，Tianjin 300071，China；3.Tianjin University of TraditionalChinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To investigate the inhibition of Xiaoyan decoction and decomposed recipe on A549 in vitro and its possiblemechanism.Explore themosteffective composition and concentration of Xiaoyan decoction.［M ethods］According to the effect，Xiaoyan decoction was divided into threegroups:Qingre Jiedugroup，Huoxue Huayugroup and Yiqi Fuzhenggroup.Use CCK 8 method to detect proliferation activity of A549 lung adenocarcinoma cancer cells.［Results］Groups had obvious inhibitory effectof cancer cell activity. The inhibition of strength in the orderwas Xiaoyan decoctiongroup，Qingre Jiedugroup，Huoxue Huayugroup and Yiqi Fuzhenggroup.［Conclusion］Xiaoyan decoction and decomposed recipegroupshaveobvious inhibitory effecton A549 cellsactivity.Xiaoyan decoction（50g/L）showsmore inhibition on A549 cellswith the lowestcell viability and is time-dependent.Effectof Qingre Jiedugroup is close to Xiaoyan decoction，and suggests thatQingre Jiedugroup is themosteffective components foranti-tumoreffectof the experiment in vitro of Xiaoyan decoction.

Xiaoyan decoction；A549 lungadenocarcinoma cancer cell；inhibition in vitro

R734.2

A

1672-1519（2015）07-0424-04

天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20120216）；天津市科學(xué)技術(shù)委員會課題（14JCZDJC36900）。作者簡介：李小江（1980-），女，醫(yī)學(xué)博士，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合腫瘤學(xué)研究工作。

賈英杰，E-mail：zxqlovelxj@126.com。

（2015-02-14）