適用于不同產(chǎn)地半夏藥材的特異性引物PCR鑒定分析方法

陳蓉，吳成麗，鄧赟，卞金輝

適用于不同產(chǎn)地半夏藥材的特異性引物PCR鑒定分析方法

陳蓉1，吳成麗1，鄧赟2，卞金輝2

目的：通過特異性引物PCR技術(shù)，建立不同產(chǎn)地半夏藥材通用的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒別法。方法：提取不同產(chǎn)地半夏藥材的基因組DNA，利用特異性引物對基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果：所設(shè)計的引物能夠特異性地擴(kuò)增出半夏的目的DNA，并適用于全國9個主要不同產(chǎn)地半夏藥材的檢測。結(jié)論：該方法具有較強(qiáng)的特異性和普適性，適用于半夏藥材的真?zhèn)涡澡b別。

半夏；特異性引物；PCR

半夏為天南星科植物半夏Pinellia ternata （Thumb.）Breit.的干燥塊莖，中醫(yī)認(rèn)為半夏具有降逆止嘔，燥濕化痰，消痞散結(jié)的功效，目前被應(yīng)用于藿香正氣水、藿香正氣液等藿香正氣系列產(chǎn)品中，具有良好的臨床療效［1，2］。由于商業(yè)需求量大，加之巨大經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使，目前中藥市場上充斥著大量半夏的混偽品如虎掌半夏、水半夏、天南星［3］等。由于天南星科植物缺乏特征的理化特性，利用傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法難以鑒別半夏藥材及其混偽品。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，李萍等利用RFLP技術(shù)成功地將川貝母和其他貝母類藥材進(jìn)行了鑒別［4，5］，Peng Xiaoxiao等建立了PCR-RFLP鑒別金銀花的DNA分子鑒定方法［6］，《中國藥典》也收錄了烏梢蛇和蘄蛇的特異性引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）鑒別法［7］?；诖耍疚慕⒘税胂乃幉牡奶禺愋砸颬CR鑒定法，并對來自全國各主要半夏產(chǎn)地的半夏藥材進(jìn)行了分析鑒定。

1　材料和方法

1.1材料

不同產(chǎn)地的半夏藥材及其混偽品虎掌半夏、水半夏、天南星由太極集團(tuán)提供并鑒定；半夏對照藥材購自中國藥品生物制品鑒定所；DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，EasyTaq系列，目錄號AP111； Roche dNTP 購自成都奧克生物技術(shù)有限公司；核酸染料購自北京百泰克公司，GELVIEW系列，目錄號EP1501；引物由上海生工生物工程公司合成并純化。

1.2 基因組DNA的提取

將半夏藥材用一次性手術(shù)刀片，切去表面易被污染部分，刮取中間干凈部分并碾成粉末，照CTAB法［8］提取，置4℃冰箱備用；同法提取半夏混偽品及半夏對照藥材DNA作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)模板。

1.3引物設(shè)計

從genbank下載半夏、虎掌半夏、水半夏、天南星的ITS序列，序列號分別為：AF469036.1、AF469040.1、AM777883.1和JF975897.1同時利用Mega軟件對序列進(jìn)行比對分析，選取半夏特異性位點，按照引物設(shè)計黃金法則設(shè)計引物為BP：5’-GGGAGACTCCCGACGATCGCA，BRP:5-GCCGCACGGACGGATGGAT。

1.4聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

將提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增采用50 μL體系，其中包括10×Taq buffer 5μL； Taq酶2.5個單位；正向引物0.25μM； 反向引物0.25μM；dNTPs 0.2 mM；基因組DNA模板1μL；滅菌水補(bǔ)足50μL。PCR反應(yīng)程序：95℃解鏈3分鐘；94℃變性30秒，62℃復(fù)性30秒，72℃延伸30秒，循環(huán)30次；72℃延伸5分鐘，得擴(kuò)增樣品。

1.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測

取擴(kuò)增產(chǎn)物5 μL加1μL 上樣緩沖液于2%瓊脂糖凝膠電泳7分鐘后，在瓊脂糖凝膠成像系統(tǒng)中檢測。

2　實驗結(jié)果

所設(shè)計的特異性引物只能擴(kuò)增出半夏的特異性條帶，而其混偽品種在相同位置均沒有擴(kuò)增條帶，見圖1。

圖1　引物特異性考察

半夏引物對全國9個半夏產(chǎn)地的半夏藥材均能擴(kuò)增出目標(biāo)條帶，并與半夏對照藥材在相同位置具有相同的條帶，見圖2。

圖2　不同產(chǎn)地藥材擴(kuò)增結(jié)果

3　討論

實驗結(jié)果表明所設(shè)計的半夏引物能且僅能擴(kuò)增出半夏特異性目的條帶，說明該引物具有高度特異性，可以從半夏及其混偽品種中特異性的檢測出半夏的存在。全國9個半夏產(chǎn)地的半夏藥材均能擴(kuò)增出目的DNA條帶，說明該引物具有良好的普適性，對各地區(qū)所產(chǎn)的半夏藥材均能成功檢出。半夏藥材作為大宗常用藥材，由于其缺乏特征的理化性質(zhì)，目前對其質(zhì)量控制還沒有特異性的方法，僅憑經(jīng)驗鑒別誤差大，人力資源有限，本文提供了一種能夠快速準(zhǔn)確鑒定半夏藥材真?zhèn)涡缘姆椒?，如能加入藥典，廣泛應(yīng)用，對保證中藥臨床用藥的安全性和有效性，以及推進(jìn)中藥的現(xiàn)代化、國際化都具有非常重要的意義。

［1］卿玉玲，孫克宏，鄭飛鳴，等.藿香正氣液治療胃腸型感冒臨床觀察［J］.重慶醫(yī)學(xué)，2006，35（06）:548.

［2］伍韶容.藿香正氣液治療小兒胃腸型感冒的療效觀察［J］.北方藥學(xué)，2015，12（03）:89.

［3］唐曉晶.DNA分子標(biāo)記在中藥材鑒定中的應(yīng)用研究［D］.北京:中國中醫(yī)科學(xué)院，2006.

［4］Wang C. Z.，Li P.，Ding J. Y.，et al.Simultaneous identifi cation of Bulbus Fritillariae cirrhosae using PCR-RFLP analysis［J］. Phytomedicine，2007，14（9）:628.

［5］徐傳林，李會軍，李萍，等.川貝母藥材分子鑒定方法研究［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報，2010，41（03）:226.

［6］Peng X.，Li W.，Wang W.，et al.Identification of Lonicera japonica by PCR-RFLP and allele-specific diagnostic PCR based on sequences of internal transcribed spacer regions［J］. Planta Med，2010，76（5）:497.

［7］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:72，349.

［8］Chen Rong，Dong Juan，Cui Xin，et al.DNA based identification of medicinal materials in Chinese patent medicines［J］.Sci. Rep.，2012，2.

（責(zé)任編輯：蔣淼）

A general detection method of Banxia from different habitats based on specifi c primers PCR

CHEN Rong1, WU Chengli1, DENG Yun2, BIAN Jin-hui2
(1. School ofEthnomedicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan;2. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: Establish a general detection method of Banxia from different habitats based on specifi c primers PCR. Method: Genetic DNA of Banxia from different habitats was extracted and amplified by specific primers. The PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis. Result: The target DNA of Banxia was successfully detected in the samples from 9 habitats. Conclusion: This method is specifi c and can be generally used in the identifi cation of Banxia.

Banxia； specifi c primers； PCR

R 284.1

A

1674-926X（2015）06-005-02

四川省教育廳理工科一般項目（14ZB0077）；成都中醫(yī)藥大學(xué)科技發(fā)展基金（ZRQN1434）；四川省科技廳項目（2014SZ0071-4）

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都611137 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都 611137

陳蓉（1987-），女，碩士，助教，主要從事中藥DNA分子鑒定研究Tel:028-61800094Email:CDTCM_CR@163.com

卞金輝（1975-），男，副教授，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Tel:028-61800127Email:bianjinhui1975@126.com

2015-09-12