八正散對腺性膀胱炎模型大鼠α1D-AR與Ki-67表達研究

尤耀東，黃曉朋，廖婷婷，俞旭君，陳曉洋，常德貴

八正散對腺性膀胱炎模型大鼠α1D-AR與Ki-67表達研究

尤耀東，黃曉朋，廖婷婷，俞旭君，陳曉洋，常德貴

目的：探討八正散對腺性膀胱炎模型大鼠α1D-AR、Ki-67影響機制。方法：以腺性膀胱炎模型大鼠為研究對象，隨機分為空白組、模型組、對照組、八正散高、中、低劑量組，對照組給予羥基喜樹堿（3 mg/kg·d）給予膀胱灌注，八正散高、中、低劑量組分別給予同體積八正散液（生藥濃度0.84、0.42、0.21 g·mL-1），每日2次，灌注/灌胃連續(xù)2周。HE染色觀察膀胱病理變化，免疫組織化學法觀察膀胱組織中的α1D-AR、Ki-67表達。結果：各組之間比較α1D-AR含量并無明顯差異；與模型組比較，高劑量組、對照組能夠下調(diào)Ki-67含量。結論：八正散可以有效改善腺性膀胱炎模型大鼠膀胱病變程度，推測與下調(diào)Ki-67含量有關。

腺性膀胱炎；八正散；α1D-AR；Ki-67蛋白

腺性膀胱炎（cystitis glandularis，CG）是一種較特殊的膀胱上皮增生性和化生性病變，隨著人們生活方式和環(huán)境的改變，泌尿外科腔內(nèi)技術的發(fā)展以及病理診斷技術的提高，CG的檢出率呈逐年增高的趨勢。臨床CG發(fā)病率約為0.9%～1.9%［1］。多數(shù)研究者認為CG與膀胱癌之間有一定相關性，是膀胱尿路上皮癌的一種癌前病變［2］。CG已嚴重威脅著患者的健康。

1　儀器及試劑

1.1材料

成年雌性健康SD大鼠60只，體重（240±25）g，由成都中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)合格證號：SCXK（川）2013-15。八正散煎劑按車前子、瞿麥、萹蓄、滑石、梔子、炙甘草、木通、大黃八味藥各9g計；戊巴比妥鈉5g（北京普博斯生物）；羥基喜樹堿注射劑（規(guī)格5mL:5mg，哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司，H20033506）；大腸埃希桿菌種（ATCC 25922上海北諾生物科技有限公司）。

1.2主要試劑及設備

Ki67蛋白抗體（批號：bs-2130R，兔多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司）；α1D-AR（批號：bs-1063R，兔多克隆抗體，北京博奧森生物技術有限公司）；生物素化山羊抗兔IgG（H+L）（批號：13152A11）；辣根酶標記鏈霉素卵蛋白素（HRP/A-V）（批號：13152A11）；封閉用正常山羊血清（批號：13152A11）；顯色劑：濃縮型DAB試劑盒（批號：K135925C），以上試劑來自北京中山金橋生物有限公司；全自動封閉式組織脫水機TSJ-Ⅱ型：（上海五相儀器儀表有限公司）；病理組織漂烘儀PHY-Ⅲ型（北京世紀科信科學儀器有限公司）；分光光度儀（博威興業(yè)科技發(fā)展有限公司）等。

2　方法

2.1造模及給藥

大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，將60只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、對照組及八正散高、中、低劑量組各10只。參照易憬等［6］、位志峰等［7］造模方法。除空白組外，其余各組采用大腸埃希菌溶液（105～109CFU/100wL濃度），每隔2天灌注雌性SD大鼠膀胱以誘導產(chǎn)生腺性膀胱炎。45天后，空白組及模型組給予生理鹽水灌胃，每日2次。對照組給予羥基喜樹堿（3 mg/kg·d）給予膀胱灌注，八正散高、中、低劑量組分別給予同體積八正散液（生藥濃度0.84、0.42、0.21 g·mL-1），每日2次，灌注/灌胃連續(xù)2周。

2.2觀察及檢測

2.2.1一般觀察 每日巡查，觀察并記錄大鼠一般活動如飲食量、飲水量，大鼠毛色、糞便形狀等。

2.2.1膀胱病理觀察 灌注/灌胃2周后處死大鼠，觀察大鼠膀胱大體情況，10%甲醛溶液固定膀胱組織。進行膀胱組織HE染色切片固定，在高倍鏡視野下觀察組織切片，記錄并分析。

離衢州不遠的南北群山，四十九軍王鐵漢部，七十四軍王耀武部早已布下重兵，只等日軍合圍衢州，再來個南北夾擊反包圍，到那時，他陳頤磊的八十六軍將來個中心開花，聚殲日軍從華東、華北拼湊而來的十萬驕兵。

2.2.2α1D-AR、Ki-67檢測 采用S-P法，根據(jù)組織細胞膜、細胞漿或細胞間質(zhì)等表達的不同顏色，來判斷膀胱組織免疫組化表達情況，結果進行圖像采集及分析。

2.3統(tǒng)計學分析

應用SPSS17.0 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-way ANOVA），數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3　結果

3.1一般活動

造模各組大鼠均有不同程度的攝食減少，惡寒倦臥，反應遲鈍，少動，毛發(fā)枯黃等現(xiàn)象。上述情況在八正散灌胃及羥基喜樹堿灌注后逐漸開始改善。

3.2膀胱病理觀察

空白組膀胱粘膜、肌層、漿膜三層完好，未見變性、壞死及炎細胞浸潤，膀胱黏膜組織黏膜光滑，顏色均一淡紅。模型組膀胱三角區(qū)及黏膜固有層大量炎細胞浸潤，間質(zhì)水腫，局灶性壞死，黏膜固有層內(nèi)有Brunn巢及腺上皮化生。對照組膀胱黏膜固有層少量炎細胞浸潤，間質(zhì)輕度水腫，局灶性壞死，黏膜固有層內(nèi)Brunn巢及腺上皮化生較模型組明顯減少。高劑量組病變基本同藥物組。中劑量組病變較模組有所減輕，但炎細胞浸潤程度及黏膜固有層內(nèi)Brunn巢及腺上皮化情況較灌藥高劑量組略重。低劑量組病變基本同模型組。病理圖示詳見（圖1）

3.3對α1D-AR、Ki-67的影響

表1　 八正散對大鼠膀胱組織α1D-AR、Ki-67平均光密度的影響（x±SD）

結果（表1，圖2、3）顯示：與空白組比較，模型組Ki-67顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與模型組比較，對照組及高劑量組Ki-67顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

4　討論

傳統(tǒng)中醫(yī)并無CG一癥，按臨床表現(xiàn)，大多數(shù)學者將CG歸屬于中醫(yī)“淋證”中熱淋、濕熱淋、血淋等范疇。核心病機總結為濕熱蘊結，膀胱氣化不利。臨床顯示，中醫(yī)藥在治療CG方面特色明顯，治療原則上以清熱利濕、利尿通淋為主。八正散源于《太平惠民和劑局方》，是目前治療濕熱淋證的常用經(jīng)典方之一。方中集木通、滑石、車前子、瞿麥、萹蓄諸利水通淋之品，清利濕熱。伍以梔子清泄三焦?jié)駸?，大黃泄熱降火，甘草調(diào)和諸藥而止莖中作痛，加少量燈心可導熱下行。疏利下焦而不專于治下，清瀉合法，組方用藥側重于苦寒通利。以清利膀胱為中心，并行清肺肅上源，降心火利小腸，泄?jié)駸嶙叽竽c，有“疏鑿分消”之巧。體外抗菌實驗表明，八正散對于變形桿菌、大腸桿菌等均有一定的抗菌作用，對金黃色葡萄球菌有較強的抗菌作用［8］。現(xiàn)代藥理研究證實八正散組成諸藥如萹蓄、瞿麥等皆具有不同程度的利尿和抗炎作用［9］。

目前比較統(tǒng)一的CG發(fā)病認知為CG的產(chǎn)生與慢性感染、尿路梗阻、排尿功能障礙等所導致的急、慢性膀胱內(nèi)炎癥密切相關。CG的臨床癥狀常見以尿頻、尿急為主的膀胱過度活動癥（overactive bladder，OAB），與逼尿肌與尿道括約肌不隨意收縮作用有關。腎上腺素能受體（adrenergic receptor，AR）是神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素和腎上腺素在靶細胞上的特異性受體，可分為α1、α2、β三類。其中α1-AR主要分布在逼尿肌、膀胱頸等，可使平滑肌收縮，產(chǎn)生排空效應；α1受體功能亢進時則可誘發(fā)膀胱逼尿肌不穩(wěn)定，引起不穩(wěn)定膀胱。Mally［10］研究發(fā)現(xiàn)人類膀胱逼尿肌上α1D-AR約占66%。CG患者膀胱逼尿肌層、三角區(qū)肌層α1D-AR表達增加，活性增強，可能是引起CG逼尿肌壓升高、不穩(wěn)定膀胱的原因之一［11］。通過測定實驗各組對大鼠膀胱組織α1D-AR平均光密度的影響，結果顯示藥物組及八正散組α1D-AR含量與空白組并無明顯差異。Ki67是一種與增殖細胞相關的核抗原，可以準確反映細胞增殖活性，是目前應用最廣泛的細胞增殖標志之一［12～13］。臨床研究顯示定期膀胱灌注化療，可以使膀胱組織中Ki-67含量下調(diào)［14～17］。不同類型腺性膀胱炎膀胱鏡下Ki-67基礎表達率明顯不同。Ki-67陽性表達率越高，與正常膀胱黏膜差異性越大［18～20］。通過檢測Ki-67在膀胱組織的表達情況，來判斷臨床膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展、預后等情況［21］。表3結果顯示八正散、羥基喜樹堿能夠下調(diào)Ki-67含量。本課題改善大鼠一般情況及病理，可能與下調(diào)Ki-67表達相關。

通過本課題研究，我們發(fā)現(xiàn)八正散能夠改善腺性膀胱炎大鼠一般情況及大鼠膀胱病理性改變。但并不能下調(diào)膀胱組織α1D-AR含量，對逼尿肌功能作用可能通過其他途徑，有待進一步深入研究。此外，藥物組、八正散灌高組能下調(diào)Ki-67含量，下調(diào)含量程度與八正散的濃度呈正相關量效關系。實驗證實八正散能夠抑制腺性膀胱炎模型大鼠細胞增殖活性，八正散最佳治療劑量有待我們進一步深入研究。

［1］Delnay K M，Stonehill W H，GoldmanH，et al. Bladder histological changes associated with chronic indwelling urinary catheter［J］. JUroU999，161（4）:l106.

［2］Tong R S，LamerT，inlayM，et al. Pelvic lipomatosis associated with proliferative cystitis occurring in two brothers［J］. Urology，2002，59（4）:602.

［3］梁勇，劉建輝，黃鳳鳴，等.120例腺性膀胱炎的診斷和治療［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2008，30（3）:266.

［4］曾偉，陳志強，葉章群.下尿路感染與腺性膀胱炎關系的臨床研究［J］.臨床泌尿外科雜志，2004（6）:350.

［5］潘英.八正散加減治療膀胱炎35例觀察［J］.實用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2006，20 （1）:85.

［6］易憬，熊飛，蘇良平，等.SD大鼠腺性膀胱炎動物模型的建立［J］.臨床外科雜志，2008，16（8）:553.

［7］位志峰，陳志強，葉章群.膀胱內(nèi)灌注脂多糖建立腺性膀胱炎動物模型的研究［J］.臨床泌尿外科雜志，2006，21（12）:933.

［8］朱雪瓊，朱建龍，林希，等.八正散加減治療腺性膀胱炎療效觀察［J］.中醫(yī)藥學報，2010，38（1）:99.

［9］袁海鑫，辛士永，史海軍.八正散合桃核承氣湯治療Ⅲ型慢性前列腺炎的臨床研究.［J］.光明中醫(yī)，2014，29（4）:727.

［10］Granados E A，Algaba F，Vicente Rodriguez J. Cystitis glandularis［J］. Arch EspUrol，2009，52（2）:119.

［11］FerrandinaG，RanellettiFO，LaroccaLM，et al.Tamoxifenmodulales the expression of Ki67，apoptosis，and microvessel density in cervical cancer［J］.Clin Cancer Res，2001，7（9）:2656.

［12］Kruse AJ，BaakJP，JanssenEA，et al.Ki67 predicis progression in early CIN: validation of a multivariate progression-risk model［J］.Cell Oncol，2004，26（1-2）:13.

［13］Kruse AJ，BaakJP，JanssenEA，et al.Ki67 predicis progression in early CIN: validation of a multivariate progression-risk model［J］.Cell Oncol，2004，26（1-2）:13.

［14］DuchrowM，GerdesJ，SchluterC，et al.The proliferationassociated Ki67 protein:defi nition in molecular terms［J］.Cell Prolif，1994，27（5）:235.

［15］倪少濱，陳起引，鄧索.P53和bcl-2在腺性膀胱炎及膀胱癌組織中的表達與意義［J］.中華外科雜志，2004，42（8）:500.

［16］方海偉，程躍，蔣軍輝，等.p53、ki67腫瘤標志物在不同分型腺性膀胱炎中的表達及臨床意義［J］.中國中西醫(yī)結合外科雜志，2010，16（2）:183.

［17］陳志強，位志峰，葉章群，等.腺性膀胱炎中腫瘤相關指標的改變和臨床分型的探討［J］.中華醫(yī)學雜志，2005，86（26）:1842.

［18］何屹，張志根，丁偉，等.腺性膀胱炎CK20、Ki-67表達意義的研究［J］.臨床醫(yī)學，2007，27（9）:79.

［19］Fechner G，Perabo G，Schmidt DH，et al.Preclinical evaluation of a radiosensitizing effect of gemcitabine in p53 mutant and p53 wild type bladder cancer cells［J］.Urology，2003，61（2）:468.

［20］Malmstrom PU，Ren ZP，Sheriff A，et al.Early metastatic progres sion of bladder carcinoma:molecular profile of primary tumor and sentinel lymph node［J］.J Urol，2002，168（5）:2240.

［21］Rau AR，Kini H，Pai RR.Morphological evaluation of cystitis glandularis［J］.Indian J PatholMicrobiol.2009，52（2）:203.

［22］張海峰，鄭國有，楊立新.p53、Ki-67基因表達與膀胱癌生物學特性的研究［J］.中國老年學雜志，2005，7（29）:1744.

（責任編輯：陳思敏）

The infl uence of Bazheng San on α1D-AR and Ki-67 expression of rats with cystitis glandularis

YOU Yao-dong, HUANG Xiao-peng, LIAO Ting-ting, YU Xu-jun, CHEN Xiao-yang, CHANG De-gui
(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, Sichuan)

［Abstract］Objective: To study the infl uence mechanism of Bazheng San on α1D-AR and Ki-67 in rats with cystitis glandularis（GC）. Method: GC rat was used and divided into blank group，model group，control group，high，medium and low dose of Bazheng San group. 3mg/kg·d hydroxycamptothecine （HCPT） were given by irrigation of bladder administration to control group. High，medium and low dose （0.84，0.42、0.21 g·mL-1） of Bazheng San group were given Bazheng San by intragastric administration 2 times a day for 2 weeks. Histopathological change of bladder was observed with HE. The expression of α1D-AR and Ki-67 of GC rats bladder was observed with immunohistochemistry. Results:The content of α1D-AR in bladder tissues from CG rats showed no obvious difference among all groups. And immunofl uorescence data revealed that Ki-67 content in the bladder tissues of GC rats in high dose treatment group and control group were down-regulated signifi cantly compared with models. Conclusion: From the experiment we suggest Bazheng San can ameliorate the bladder pathological change in CG rats bladder by reducing the Ki-67 content.

Glandular cystitis； Bazheng San； α1D-AR； Ki-67

R 285.5

A

1674-926X（2015）06-011-03

四川省教育廳科技項目（13ZB0317）；成都中醫(yī)

藥大學科技發(fā)展基金項目（030018007）

成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院，四川 成都 610075［作者簡介］尤耀東，講師，主要從事中西醫(yī)泌尿男科臨床與

基礎研究

Tel:18908170788Email:yyd110@163.com

常德貴，主任中醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)泌尿男科

臨床與基礎研究

Tel:18980880133Email:cdg998@sina.com

2015-08-13