正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選龍膽中龍膽總苷的提取工藝

向志蕓，李小芳，羅開沛，羅佳，楊露，林浩，劉海霞

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選龍膽中龍膽總苷的提取工藝

向志蕓，李小芳，羅開沛，羅佳，楊露，林浩，劉海霞

目的：采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化龍膽中龍膽總苷的提取工藝。方法：通過預(yù)實(shí)驗(yàn)和單因素試驗(yàn)，最終選用回流提取法，并以乙醇濃度、乙醇的體積、提取時(shí)間為自變量，龍膽總苷的百分含量為因變量，采用 L9（34） 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)最終確定龍膽的最佳提取工藝。結(jié)果：龍膽的最佳提取工藝為：60%的乙醇提取3次，乙醇用量為12倍，提取時(shí)間為第1次2小時(shí)，第2次1小時(shí)，第3次1小時(shí)。龍膽總苷的百分含量能達(dá)到8.73%。結(jié)論：正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化龍膽中龍膽總苷的提取工藝，環(huán)保，能耗低，方法簡便，提取效率高，預(yù)測性良好。

龍膽；龍膽總苷；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

龍膽（Gentiana chinensis）為龍膽科植物條葉龍膽Gentiana manshurica Kitag、龍膽Gentian.a scabra Bge.、三花龍膽Gentiana trifl ora Pall.或滇龍膽Gentiana rigescens Franch.的干燥根和根莖。前三種習(xí)稱“龍膽”，后一種習(xí)稱“堅(jiān)龍膽”。具有清熱、瀉肝、定驚之功效。據(jù)本草綱目［1］記載，因其葉如龍葵，味苦如膽，因此而得名。根據(jù)化學(xué)成分研究表明，龍膽苦苷（gentiopicroside，GTP）是龍膽科植物龍膽、秦艽等的活性最強(qiáng)的有效成分之一［2］。現(xiàn)代藥理研究證明龍膽苦苷具有對(duì)多種肝損傷具有顯著地保護(hù)作用，還具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎鎮(zhèn)痛的作用，具有非常重要的開發(fā)價(jià)值［3］。為更好的開發(fā)利用它，本研究通過紫外-可見分光光度法及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)選龍膽總苷的提取工藝，為龍膽總苷的有效開發(fā)利用、工業(yè)化生產(chǎn)和劑型研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　儀器與試藥

UV-6100型紫外可見分光光度計(jì)，PS-60A型超聲波清洗器，BP-61 電子天平，B-260恒溫水浴鍋，Q-250B3型高速多功能粉碎機(jī)，龍膽飲片購于四川新荷花中藥飲片股份有限公司 （ 批號(hào): 1111044，產(chǎn)地：云南），粉碎至粗粉，備用。龍膽苦苷對(duì)照品購于成都曼思特生物科技有限公司（ 批號(hào): MUST-14081205），其他試劑均為分析純。

2　方法和結(jié)果

2.1方法學(xué)考察

2.1.1對(duì)照品溶液的制備 將龍膽苦苷對(duì)照品置于五氧化二磷干燥器中干燥12 h以上，于十萬分之一天平精密稱取0.00328 g置25 mL棕色容量瓶中，先用l0 mL 70%乙醇溶解，再加乙醇定容至刻度，搖勻，即得。

2.1.2供試品溶液的制備 取龍膽藥材粗粉（過5號(hào)篩）1 g，用10倍量70%乙醇80 ℃加熱回流提取1.5 h，提取液過濾，再用8倍量70%乙醇加熱回流提取1.5 h，提取液過濾，合并濾液，備用。

2.1.3最大吸收波長的確定 分別取一定濃度的龍膽苦苷對(duì)照品溶液和供試品溶液在200～800 nm范圍進(jìn)行波長掃描，結(jié)果對(duì)照品和供試品均在274 nm處有較強(qiáng)吸收，故選擇274 nm為最大吸收波長。

2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以龍膽苦苷為標(biāo)準(zhǔn)物，精密吸取0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0mL、3.5 mL于容量瓶中，得龍膽苦苷濃度為6.56 g·mL-1、13.12 g·mL-1、19.6 g·mL-1、26.24 g ·mL-1、32.8 g·mL-1、45.92 g·mL-1的溶液，以70%乙醇稀釋至刻度，用紫外分光光度計(jì)在274 nm處，以70%乙醇為隨行空白，測定吸光度，所得結(jié)果以龍膽苦苷溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作線性回歸，得回歸方程為Y=0.0192X+0.0114，（r=0.9991），對(duì)照品濃度在6.56 g·mL-1～45.92 g· mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度試驗(yàn) 取同一對(duì)照品溶液，以70%乙醇為隨行空白，在所確定波長處測定吸光度，連續(xù)測定五次，吸光度分別為：0.400、0.401、0.401、0.400、0.401，得RSD=0.14%，結(jié)果表明，龍膽苦苷進(jìn)樣精密度良好。

2.1.6樣品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液在室溫下放置，分別于0、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣測定，統(tǒng)計(jì)測得濃度的RSD值。結(jié)果表明，供試品溶液室溫下2 d內(nèi)穩(wěn)定，RSD為0.2%，表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.1.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一龍膽樣品5份照“2.1.2”項(xiàng)下制備方法制備樣品溶液進(jìn)行試驗(yàn)，測定每份樣品中龍膽苦苷的百分含量。RSD為1.2%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.1.8加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批己知含量的龍膽藥材粉末9份，每份約100 mg，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入GTP對(duì)照品溶液，制備供試品溶液，測定龍膽苦苷的含量，計(jì)算高、中、低3種質(zhì)量濃度的平均回收率及RSD，分別為101.2%（RSD=0.23%）、99.8%（RSD=0.41%）、98.4%（RSD=0.50%），平均回收率為99.8%，RSD為 0.38%，說明該方法回收率良好。

2.2提取方法篩選與單因素考察

為了保證實(shí)驗(yàn)操作方便可行以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果精確，以龍膽苦苷的百分含量為指標(biāo)，先進(jìn)行提取方法的篩選，在此基礎(chǔ)上在進(jìn)行單因素的考察。

2.2.1提取方法的篩選 超聲提取:取龍膽藥材粗粉（過5號(hào)篩）1 g，加10倍量70%乙醇，超聲提取30 min，過濾，再加8倍量70%乙醇，超聲提取30 min，過濾，合并濾液，備用。

加熱回流提?。喝↓埬懰幉拇址郏ㄟ^5號(hào)篩）1 g，用10倍量70%乙醇80 ℃加熱回流提取1.5 h，提取液過濾，再用8倍量70%乙醇加熱回流提取1.5 h，提取液過濾，合并濾液，備用。

冷浸提?。簻?zhǔn)確稱取龍膽藥材粗粉（過5號(hào)篩）1 g，加l0倍量70%乙醇，冷浸12 h，再加8倍量70%乙醇，冷浸12 h，抽濾，合并濾液，備用。

將上述所得的3種提取液定容，測定龍膽苦苷的百分含量分別為5.87%、6.47%、6.10%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，回流提取法提取效果較好。

2.2.2單因素實(shí)驗(yàn)考察 分別考察了乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、乙醇體積（8、10、12、15、20倍）、提取時(shí)間（1h、2h、3h、4h）、提取次數(shù)（1、2、3、4次）等因素對(duì)提取龍膽苦苷的影響，有實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：提取溶媒乙醇濃度在60%～80%時(shí)，提取效果較好；提取溶劑用量為12倍、15倍、20倍時(shí)，GTP提出量顯著高一些；提取2 h以上時(shí)，GTP提出量差別不大；提取3次是最適宜的。

2.3正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果，選擇對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大的3個(gè)因素即乙醇濃度（A）、乙醇用量（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，提取物中GTP的百分含量（Y）為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交表，進(jìn)行4因素3水平設(shè)計(jì)，因素水平表見表1。精密稱取龍膽藥材粗粉1 g，按正交表依次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，提取次數(shù)為3次，所得溶液濾過，用紫外分光光度計(jì)測定所含龍膽總苷的含量。正交試驗(yàn)安排見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表1　正交設(shè)計(jì)因素水平表

表2　正交實(shí)驗(yàn)安排表

表3　方差分析表

由極差分析結(jié)果可見，影響龍膽苦苷百分含量的因素順序?yàn)樘崛r(shí)間＞提取濃度＞溶劑用量，P（A）＜0.05，P（C）＜0.05，說明提取濃度和提取時(shí)間為重要因素，P（C）＞0.05，說明提取溶劑的倍數(shù)的影響沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可任選。因此，綜合考慮生產(chǎn)實(shí)際，盡量節(jié)約成本，確定龍膽最優(yōu)提取方案應(yīng)為：60%的乙醇提取3次，溶劑用量12倍，提取時(shí)間為第1次2小時(shí)，第2次1小時(shí)，第3次1小時(shí)。

按優(yōu)化得到的加熱回流提取工藝重復(fù)提取三次，計(jì)算GTP提出量結(jié)果分別為8.54%、8.64%、9.02%，結(jié)果表明該加熱回流提取工藝重現(xiàn)性良好，工藝穩(wěn)定可行。

3　討論

龍膽苦苷作為龍膽的主要活性成分，具有顯著的抗肝損傷、抗病毒、抗炎作用，具有重要的開發(fā)價(jià)值。但是龍膽苦苷的提取率低嚴(yán)重阻礙了其開發(fā)利用，本研究旨在通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)選出其最佳提取工藝，為龍膽苦苷的生產(chǎn)及其開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)參考。

［1］ 現(xiàn)代本草綱目［M］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2001.

［2］楊書彬，王承. 龍膽化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展［J］. 中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2006，33（6）: 54.

［3］劉占文，陳長勛，金若敏，等. 龍膽苦苷的保肝作用研究［J］.中草藥，2002，33（1）: 47.

（責(zé)任編輯：傅舒）

Study on the extraction technology of total gentiin in Longdan by orthogonal design method

XIANG Zhi-yun, LI Xiao-fang, LUO Kai-pei, LUO Jia,YANG Lu, LIN Hao, LIU Hai-xia
(Chengdu University of TCM; Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese herbal medicines;System of traditional Chinese medicine resources and Development Utilization of Ministry of State Key Laboratory Breeding Base, Chengdu 611137, China)

Objective: To optimize the extraction technology of total gentiin in Longdan using orthogonal design method. Method: Pre-test and one-factor test were carried to optimize the technology and refl ux extraction was selected. Ethanol concentration，ethanol volume and extraction time were used as independent variables，the percentage of total gentiin was used as the dependent variable. L9（34） orthogonal experimental design was applied to ultimately determine the best extraction process. Result: The optimal extraction process of gentian was as follows: 60% ethanol，extract three times（2h，1h，and 1h each time） ，12 times of ethanol. Total gentiin percentage was 8.73%. Conclusion: The extraction process of total gentian optimized by orthogonal design is environmental with low energy consumption. The method is simple，and the extraction effi ciency is high with good predictability.

Longdan；total gentiin ； orthogonal design

R 283.3

A

1674-926X（2015）06-008-03

成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

向志蕓，女，碩士研究生，從事中藥新劑型及中藥新技術(shù)研究

Tel:18380228578Email:498939565@qq.com

李小芳，女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥新劑型及中藥新技術(shù)研究

Email:lixiaofang918@163.com

2014-04-16