Wnt信號(hào)通路在綿羊不同大小卵泡中的表達(dá)

趙妙妙，姜曉龍，陳建偉，黃　洋，姚曉磊，曹　霞，李鵬飛，呂麗華*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

Wnt信號(hào)通路在綿羊不同大小卵泡中的表達(dá)

趙妙妙1，姜曉龍1，陳建偉1，黃洋1，姚曉磊1，曹霞1，李鵬飛2，呂麗華1*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

為研究Wnt信號(hào)通路在綿羊不同大小卵泡中的表達(dá)情況，本試驗(yàn)選取了Wnt信號(hào)通路中的4個(gè)關(guān)鍵基因，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測其在綿羊大、中、小卵泡中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，CTNNB1、FZD6基因在大卵泡中表達(dá)相對(duì)較多，DVL1在不同大小卵泡中的表達(dá)量無明顯差異，AXIN2在中、小卵泡中表達(dá)量相對(duì)較多。隨著綿羊卵泡的增大，Wnt信號(hào)通路在卵泡中的表達(dá)也呈現(xiàn)出遞增趨勢，因此Wnt信號(hào)通路能夠促進(jìn)綿羊卵泡的發(fā)育，并且可能與雌激素的分泌有關(guān)。

綿羊；卵泡；Wnt信號(hào)通路

卵泡是哺乳動(dòng)物卵巢上的基本單位。目前人們根據(jù)卵泡成腔與否，把卵泡分為無腔卵泡和有腔卵泡。無腔卵泡包括原始卵泡、初級(jí)卵泡和沒有成腔的次級(jí)卵泡。有腔卵泡由四個(gè)不同部分構(gòu)成：壁層細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞［1］。自Wnt被發(fā)現(xiàn)以來，Wnt信號(hào)通路逐漸受到了人們的廣泛關(guān)注。目前已知的Wnt信號(hào)通路［2～6］主要有3條：（1）經(jīng)典的Wnt/β-catenin（CTNNB1）信號(hào)通路；（2）平面的細(xì)胞極性通路（planar cell polarity pathway）；（3）Wnt/Ca2+通路。其中，人們對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路了解最為深刻。當(dāng)細(xì)胞未受到刺激時(shí)，軸蛋白（AXIN2）結(jié)合到CTNNB1/糖原合酶激酶（CSK3）/結(jié)腸癌抑制因子（APC）復(fù)合體當(dāng)中，導(dǎo)致CTNNB1迅速降解，信號(hào)傳導(dǎo)通路關(guān)閉；而當(dāng)經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活時(shí)，Wnt配體與受體卷取蛋白（Frizzled，F(xiàn)ZD）以及LDL受體相關(guān)蛋白（LRP）結(jié)合形成三聚體，從而激活蓬亂蛋白（Dishevelled1，Dsh1/DVL1），使DVL1與AXIN2相結(jié)合，導(dǎo)致AXIN2/CSK3/APC/CTNNB1的復(fù)合體被破壞，CTNNB1無法被降解。因此，CTNNB1可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控［7］。目前已有大量研究證明，Wnt信號(hào)通路與哺乳動(dòng)物的繁殖存在密切的聯(lián)系。Vainio S［8］等發(fā)現(xiàn)，在LH峰后的4～12 h，Wnt信號(hào)通路受體Frizzled定位于排卵卵泡的顆粒細(xì)胞上。本試驗(yàn)選取了Wnt信號(hào)通路中的4個(gè)關(guān)鍵基因，探究Wnt信號(hào)通路在綿羊不同大小卵泡中的表達(dá)情況，為Wnt信號(hào)通路功能的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物及卵巢樣品

本試驗(yàn)選用山西省清徐縣綿羊屠宰場性成熟綿羊的健康卵巢。

1.2主要試劑

Trizol、DEPC（Invitrogen公司，美國）、固相RNase清除劑（Andybio公司，美國）、PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒、dNTP、DNA MarkerDL1000（Takara，大連）、SYBR?Premix Ex TaqTM II（Takara，大連）。

1.3卵泡及顆粒細(xì)胞的分離

將采集的健康卵巢放入滅菌的4℃杜氏磷酸緩沖液（DPBS）中，在2 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。在超凈臺(tái)內(nèi)，用眼科剪認(rèn)真分離大卵泡（卵泡直徑＞5 mm），中卵泡（3 mm＜卵泡直徑＜5 mm）和小卵泡（卵泡直徑＜3 mm），用無菌的杜氏磷酸緩沖液（DPBS）漂洗兩次。剪開卵泡并放入盛有生理鹽水的小表面皿中，用刮刀輕輕刮動(dòng)卵泡內(nèi)壁。分別收集大、中、小卵泡的顆粒細(xì)胞，加入適量Trizol，-80℃儲(chǔ)存，提取RNA備用。

1.4總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

將前面-80℃的儲(chǔ)存液從冰箱取出，用Trizol法分別提取大、中、小卵泡顆粒細(xì)胞的總RNA［10］。分別以上述提取出的RNA為模板，按照PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒說明，加入1 μL gDNA Eraser，2 μL 5×gDNA Eraser Buffer，2 μL RNA，RNase Free定容到10 μL。反應(yīng)條件設(shè)為42℃2 min，4℃∞。之后再加入1 μL RT Primer Mix，4 μL 5×PrimeScript?Buffer 2，1 μL PrimeScript?RT Enzyme Mix I，RNase Free定容到20 μL。反應(yīng)條件設(shè)為37℃15 min，85℃5 s，4℃∞。反應(yīng)結(jié)束后，檢測產(chǎn)物純度及濃度。

1.5引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI上綿羊的各目的基因的已有序列或預(yù)測序列，利用Primer 3和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)目的基因的引物；以綿羊β-Actin基因作為內(nèi)參基因，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列信息見表1。

1.6qRT-PCR反應(yīng)

以綿羊大、中、小卵泡顆粒細(xì)胞的cDNA為模板，構(gòu)建20 μL qRT-PCR反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM II（2×）10 μL，Rox Reference Dye（50×）0.4 μL，PCR Forward/Reverse Primer（10 μmol·L-1）0.8μL，cDNA模板2.0μL，ddH2O 6 μL，反應(yīng)條件為：95℃變性30 s，95℃5 s，60℃25 s，45個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增后利用其CT值分析結(jié)果。

表1　R熒光定量PCR引物序列

1.7統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 18.0進(jìn)行分析，采用單因素方差分析和顯著性檢驗(yàn)的方法。qRT-PCR相對(duì)表達(dá)量結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，采用△△CT的計(jì)算方法，相對(duì)表達(dá)量=2-△△CT。各基因表達(dá)量均經(jīng)內(nèi)參β-Actin校正。

2　結(jié)果

2.1內(nèi)參β-Actin及通路基因CTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2的擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖1為內(nèi)參β-Actin及Wnt信號(hào)通路中4個(gè)關(guān)鍵基因CTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2的擴(kuò)增曲線和熔解曲線。由圖1中可見，各擴(kuò)增曲線拐點(diǎn)清晰，曲線平滑，基線期及平臺(tái)期較平穩(wěn)，每個(gè)基因各樣品的CT值都很接近，說明該試驗(yàn)系統(tǒng)誤差小。各熔解曲線為單峰，即產(chǎn)物單一，說明該熒光定量試驗(yàn)可信度較高。

2.2CTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2在不同大小卵泡中的表達(dá)差異

利用△△CT法對(duì)CTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2在綿羊大、中、小卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖2。由圖2可以看出CTNNB1基因在大卵泡中的表達(dá)量顯著高于中卵泡和小卵泡；FZD6基因在大卵泡和中卵泡中的表達(dá)量顯著高于小卵泡；DVL1基因在大、中、小卵泡中沒有表現(xiàn)出明顯差異；AXIN2基因在中卵泡和小卵泡中的表達(dá)量顯著高于大卵泡。

圖1　Rβ-Actin、CTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2基因的擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖2　RCTNNB1、FZD6、DVL1、AXIN2在不同大小卵泡中的表達(dá)差異

3　討論

卵泡的生長機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，眾多激素和生長因子通過內(nèi)分泌、自分泌及旁分泌途徑調(diào)節(jié)其生長發(fā)育。Wnt信號(hào)通路可調(diào)控多種發(fā)生過程，如細(xì)胞程序性死亡、增殖、分化和凋亡等［11］，目前已有大量研究證明，其在哺乳動(dòng)物繁殖也存在重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在Wnt信號(hào)通路中的4個(gè)關(guān)鍵基因中，CTNNB1和FZD6基因在大卵泡中表達(dá)相對(duì)較多，在小卵泡中表達(dá)相對(duì)較少。在Wnt信號(hào)通路中，AXIN2越多，蛋白復(fù)合體降解的CTNNB1就越多，通路發(fā)揮的作用越小。因此AXIN2在大卵泡中表達(dá)量顯著少于中卵泡和小卵泡，說明通路在大卵泡中的表達(dá)高于中小卵泡。DVL1基因在大中小卵泡中的表達(dá)雖沒有表現(xiàn)出顯著地差異，但也存在逐漸下降的趨勢。綜上所述，隨著綿羊卵泡的不斷增大，Wnt信號(hào)通路在卵泡中的表達(dá)量逐漸升高，這與Gupta［12］對(duì)于Wnt信號(hào)通路在不同時(shí)期的牛卵泡發(fā)育過程中的表達(dá)研究結(jié)果一致。此外，目前已有研究證實(shí)，隨著卵泡的增大，雌激素濃度在不斷增加［13］。因此Wnt信號(hào)通路在綿羊大、中、小卵泡中的表達(dá)與雌激素濃度正相關(guān)，所以Wnt信號(hào)通路可能對(duì)卵泡中雌激素的分泌有影響。結(jié)論，Wnt信號(hào)通路可以促進(jìn)綿羊卵泡的生長，并且可能與卵泡中雌激素的分泌有關(guān)。

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S814；S826.3

A

1005-2739（2015）05-0003-04

2015-07-10

國家自然科學(xué)基金（31172211）；山西省回國留學(xué)人員科研資助項(xiàng)目（2014-重點(diǎn)5）；山西農(nóng)業(yè)大學(xué)科研管理費(fèi)資助重大項(xiàng)目和標(biāo)志性成果培育項(xiàng)目（71060003）

趙妙妙（1989-），女，山西大同人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail：1203418618@qq.com

呂麗華，E-mail：sxaullh@yahoo.com.cn