杜泊綿羊胚胎移植技術(shù)在哈密地區(qū)應(yīng)用效果觀察

羅生金，阿布都力·尼亞孜，熱孜萬(wàn)古麗，吳榮虎

(1.新疆哈密地區(qū)畜牧工作站839000;2.新疆哈密地區(qū)伊吾縣畜牧工作站839300)

胚胎移植又稱受精卵移植，最早于1890 ～1900年W.Heape 將安哥拉兔和荷蘭兔的受精卵分別移植到比利時(shí)兔的輸卵管內(nèi)，分別獲得仔兔2只。通過(guò)長(zhǎng)期試驗(yàn)直到1977年發(fā)達(dá)國(guó)家才開(kāi)始商業(yè)化應(yīng)用。我國(guó)胚胎移植從1973年開(kāi)始在卡拉庫(kù)爾羊上實(shí)施并產(chǎn)羔。1991 ～1995年，該技術(shù)逐漸成熟，開(kāi)始由實(shí)驗(yàn)室向生產(chǎn)中應(yīng)用［1］。羊的胚胎移植技術(shù)屬于生物工程技術(shù)范疇，這是指一只母羊(供體)超數(shù)排卵發(fā)情并經(jīng)過(guò)配種后，在一定時(shí)間內(nèi)從其生殖道取出胚胎或者由體外受精等技術(shù)獲得的胚胎，然后把這些胚胎移植到另外一只與供體羊同期發(fā)情或情期相同，但未經(jīng)配種的受體母羊生殖道的相應(yīng)部位，外來(lái)胚胎在受體子宮著床并繼續(xù)發(fā)育成長(zhǎng)，最后產(chǎn)下供體羊的后代，即通常所說(shuō)的“借腹懷胎”。在羊的繁殖過(guò)程中，胚胎移植作為一種新的快速繁育純種羊的方法被公認(rèn)和接受［2］。

為了豐富哈密地區(qū)肉羊品種，2013年伊吾縣喀爾里克公司北牧種羊場(chǎng)從內(nèi)蒙古引進(jìn)黑頭杜泊種公羊和母羊進(jìn)行純種繁育。但由于肉羊品種價(jià)格昂貴，運(yùn)輸路途遙遠(yuǎn)，費(fèi)用高，引進(jìn)肉羊數(shù)量有限，純種繁育進(jìn)度緩慢，繁殖率低。為了加快肉羊純繁進(jìn)度，2014年9月邀請(qǐng)新疆畜牧科學(xué)院專家來(lái)喀爾里克公司羊場(chǎng)進(jìn)行哈密地區(qū)首次杜泊綿羊鮮胚移植，以提高肉羊純種繁殖率，加速我區(qū)舍飼肉羊改良力度。筆者服務(wù)于本公司并全程參與了胚胎移植過(guò)程。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供體羊及種公羊

選取伊吾縣喀爾里克公司北牧種羊場(chǎng)提供的黑頭杜泊母羊79 只做供體羊，體重在60 ～70 kg，年齡1.5 歲，初產(chǎn)母羊，膘情中等以上。在準(zhǔn)備期制定飼養(yǎng)方案保證供體羊均衡攝入所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)做好飼喂、飲水、補(bǔ)鹽、運(yùn)動(dòng)、試情等工作。種公羊?yàn)楸緢?chǎng)2 歲以上黑頭杜泊種公羊，遺傳性能穩(wěn)定，系譜清晰，體型外貌達(dá)到品種標(biāo)準(zhǔn)，體格結(jié)實(shí)，健康無(wú)病，雄性特征明顯，精液品質(zhì)良好，膘情8 成以上。

1.1.2 受體羊與試情公羊

受體羊?yàn)楸镜毓_克羊，無(wú)繁殖性疾病及傳染病，經(jīng)檢測(cè)結(jié)核病與布病均為陰性。3 ～5 歲的經(jīng)產(chǎn)母羊，體格健壯，體重40 kg 以上，中等以上膘情。將受體羊分群，佩戴耳標(biāo)，制定防疫計(jì)劃，分期疫苗免疫和驅(qū)蟲，實(shí)行放牧+ 補(bǔ)飼的方式進(jìn)行“短期優(yōu)飼”。同時(shí)要觀察和記錄羊群情況，及時(shí)剔除老、弱、病、殘羊只，確保受體羊整體質(zhì)量。選健康無(wú)病、性欲好的本地哈薩克成年公羊做試情公羊。

1.1.3 儀器設(shè)備

專用胚胎移植手術(shù)架、內(nèi)窺鏡、B 超儀、子宮鉗、體視顯微鏡、水浴鍋、、恒溫臺(tái)、注射器若干、沖卵管、檢卵針、移植管、培養(yǎng)皿、曲別針、小彎縫合針、12 號(hào)縫合線、剃毛刀、剪毛剪等。

1.1.4 試驗(yàn)藥品

PG、FSH、LHRH-A3 等激素為寧波激素制品廠生產(chǎn);沖卵液(PBS)由新疆畜牧科學(xué)院提供，保存液新西蘭生產(chǎn);靜松靈注射液、利多卡因注射液、黃體酮注射液、160 萬(wàn)IU 青霉素、100 萬(wàn)IU鏈霉素、250 mL 甲硝唑注射液。

1.2 方法

1.2.1 供體羊的超排處理

2014年9 月對(duì)供體綿羊進(jìn)行同期發(fā)情處理。首先對(duì)供體羊全群注射PG，每只1 mL。在24 ～72 h內(nèi)每天2 次試情，做好發(fā)情記錄，按照發(fā)情先后順序分組、編制程序。對(duì)于有發(fā)情周期供體母羊根據(jù)受體羊數(shù)量在發(fā)情后9 ～12 d 開(kāi)始超排。本次采用FSH 逐日遞減法進(jìn)行處理(見(jiàn)表1)，對(duì)于沒(méi)有發(fā)情的供體羊采用埋栓法處理，用同樣的方法進(jìn)行超排處理。在第6 次超排注射時(shí)撤掉CIDR。在超排處理的第4 天取栓，供體羊在取栓的第2 天進(jìn)行試情，發(fā)情后第1 次配種后肌注LHRH-A3 半支，供體羊采用上午發(fā)情下午配種，下午發(fā)情第2天早晨配種，每只羊配種2 次。

表1 超排處理程序

1.2.2 受體羊處理

對(duì)受體羊第1 次注射PG 時(shí)與供體羊同步，第2 次注射PG 時(shí)比供體羊提前12 h，第2 次注射后24 ～72 h 觀察發(fā)情狀況并做好標(biāo)記與記錄備用。

1.2.3 供體羊沖卵

供體羊配種后第7 天進(jìn)行手術(shù)法沖卵。首先將供體羊采取前低后高半仰臥姿勢(shì)保定在手術(shù)架上，術(shù)部剃毛- 備皮- 消毒，全身麻醉、局部浸潤(rùn)麻醉。術(shù)部鋪墊一次性創(chuàng)巾，在腹部偏右側(cè)距乳房基部3 ～4 cm 處做一長(zhǎng)4 cm 的縱向切口，逐層切開(kāi)。切開(kāi)腹膜后，將食指和中指伸入腹腔，在骨盆腔前緣探尋子宮角，將子宮牽引至切口外，再把卵巢引出檢查黃體發(fā)育情況。如果黃體發(fā)育良好，用套有膠管的腸鉗夾在子宮角分叉處，開(kāi)始沖卵。先用一端帶有頭皮靜脈針的導(dǎo)管連接吸入預(yù)熱35 ℃沖卵液20 ～30 mL(一側(cè)用液50 ～60 mL)，注射器從輸卵管中部向?qū)m管結(jié)合部方向扎入，緩慢推動(dòng)注射器，感覺(jué)阻力小說(shuō)明已經(jīng)順入輸卵管，另一端將硅膠管連接集卵杯的鈍性沖卵針頭從腸鉗夾基部上方子宮體迅速扎入，沖卵液經(jīng)硅膠管收集于集卵杯內(nèi)，最后用兩手拇指和食指將子宮捋一遍。另一側(cè)子宮角用同樣方法沖洗。進(jìn)針時(shí)避免損傷血管，推注沖卵液時(shí)用力和速度應(yīng)適中。兩側(cè)沖洗完畢，將子宮送入腹腔，為防止粘連和腹膜炎，向腹腔注入34 ℃的0.9%生理鹽水250 mL +160 萬(wàn)IU 青霉素+100 IU 鏈霉素與250 mL 甲硝唑注射液。按手術(shù)常規(guī)處理，閉合腹腔。

1.2.4 胚胎檢查

操作室溫保持在20 ～25 ℃，取三個(gè)培養(yǎng)皿放置于24 ℃恒溫臺(tái)上，加入適量保存液備用。將收集好的沖卵液移去上層液，取底部少量液體移置平皿內(nèi)，靜置后，在體視鏡下先在低倍(10 ～20 倍)下檢查胚胎數(shù)量，然后在較大倍數(shù)(50 ～100 倍)下觀察胚胎質(zhì)量。根據(jù)受精卵的形態(tài)、色澤、分裂球的大小、均勻度、細(xì)胞的密度、與透明帶的間隙以及變性情況等，將胚胎分為A、B、C 3 個(gè)等級(jí)。發(fā)情后第7 天回收的受精卵在正常發(fā)育時(shí)應(yīng)處于致密桑椹胚至囊胚階段。凡在16 細(xì)胞以下的受精卵及變性細(xì)胞超過(guò)一半的胚胎均屬等外。凡卵子的卵黃未形成分裂球及細(xì)胞團(tuán)的均列為未受精卵。根據(jù)胚胎鑒定結(jié)果做好統(tǒng)計(jì)記錄。胚胎保存:吸管先吸入少許PBS 液，再吸入胚胎，將胚胎吸至第1 個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)，在培養(yǎng)皿的不同位置緩慢沖洗卵3 ～5次。依次在第2 個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)重復(fù)沖洗，然后把全部胚胎移至第3 個(gè)培養(yǎng)皿。1 個(gè)供體的卵放在同1 個(gè)皿內(nèi)，于24 ℃恒溫臺(tái)上加蓋保存，待受體羊鮮胚移植，一般保存4 ～5 h。

1.2.5 腹腔鏡法移植

將受體羊體位45° ～60°傾斜倒立保定法保定在手術(shù)架上，剃毛-備皮-消毒后，用手術(shù)刀在乳房前腹中線兩邊各切開(kāi)1 ～1.5 cm 的切口，一側(cè)套管針刺入腹腔后，抽出針芯。將觀察鏡經(jīng)管套送入腹腔，借助腹腔內(nèi)窺鏡和子宮鉗翻動(dòng)、撥開(kāi)卵巢系膜，暴露卵巢。通過(guò)目鏡觀察黃體發(fā)育情況，按突出卵巢的直徑和顏色分為優(yōu)、中、差3 個(gè)等級(jí)，優(yōu):0.6 ～0.8 cm，顏色深紅;中:0.5 cm，顏色鮮紅;差:0.3 cm，顏色粉紅。將判定合格黃體一側(cè)的子宮角前端用子宮鉗引出腹腔切口外，用曲別針避開(kāi)血管在子宮角前端扎孔，用裝好胚胎的移植針，對(duì)準(zhǔn)針孔，確認(rèn)移植針在子宮角內(nèi)腔內(nèi)，將胚胎注入到子宮角內(nèi)。移植后將子宮角恢復(fù)原位，切口縫合1 針，對(duì)于中級(jí)黃體酌情注射黃體酮注射液，解除保定。

1.2.6 供、受體羊術(shù)后處理

供、受體羊術(shù)后在小圈內(nèi)觀察1 ～2 d。圈舍應(yīng)保持干燥、清潔，加強(qiáng)護(hù)理，防止感染。對(duì)于妊娠受體羊按照肉羊營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)調(diào)整日糧，妊娠后期應(yīng)加強(qiáng)管理，防止流產(chǎn)，并做好接產(chǎn)和保羔育幼工作。

1.2.7 妊娠檢查

在受體羊妊娠45 d 時(shí)，經(jīng)B 超檢查妊娠286只，受胎率為76.2%。

2 結(jié)果與分析

2.1 受體羊同期發(fā)情效果與胚胎利用狀況

對(duì)460 只受體羊進(jìn)行兩次PG 同期發(fā)情處理，發(fā)情389 只，同期發(fā)情率達(dá)84.5%。將443 枚可用胚胎移375 只受體羊，其中237 只受體移入單胚，138 只受體移入雙胚，移植成功率達(dá)76.2%。但從處理的389 只受體羊看，有7 只黃體發(fā)育不太好，4 只有包蟲病做淘汰處理，2 只未排卵。同期發(fā)情處理的效果比較好，黃體發(fā)育良好，受體羊可利用率達(dá)96.4%。

表2 受體羊同期發(fā)情與移植

2.2 供體羊沖胚

本次鮮胚移植共處理79 只供體，其中有1 只供體沖出胚胎24 枚，可用胚胎為21 枚，有11 只未沖出可用胚胎，有1 只僅沖出2 枚胚胎。本次沖出可用胚胎485 枚，其中42 枚A 級(jí)胚胎做了冷凍處理。平均沖出可用胚胎6.1 枚/只。采用PG 兩次注射法沖出可用胚胎平均數(shù)為6.2/只，采用CIDR 法沖出可用胚胎平均數(shù)為5.2 枚/只，兩者差異不顯著(P ＞0.05)。

2.3 移植胚胎數(shù)、胚胎質(zhì)量對(duì)受胎率的影響

通過(guò)這次鮮胚移植，共移植可用胚胎443 枚，共移植受體羊375 只。結(jié)果表明:移植A 級(jí)胚胎受胎率明顯高于B、C 級(jí)胚胎，胚胎利用率高，通過(guò)t檢驗(yàn)差異均顯著(P ＜0.05)，且羔羊成活率高。

3 討論

3.1 本次胚胎移植用PG 注射法與孕酮陰道海綿栓結(jié)合法對(duì)供體羊進(jìn)行處理，再結(jié)合注射FSH 遞減法對(duì)綿羊進(jìn)行超排處理是一種有效的處理方法。這次處理用PG 法處理處理有11 只羊沒(méi)有沖出可用胚胎，對(duì)于不發(fā)情羊用CIDR 法處理全部沖出可用胚胎，可見(jiàn)供體羊CIDR 法處理效果要好些。本次供體羊均為初產(chǎn)羊也是超排不利的因素之一。試驗(yàn)中采用遞減法注射FSH 劑量為100 IU/只。據(jù)張良［6］采用120 IU ～132 IU 的劑量獲得超排回收可用胚胎8.8 ～9.4 枚是最佳首選劑量。適合于我區(qū)肉羊FSH 超排劑量有待于在今后的對(duì)比試驗(yàn)中進(jìn)一步完善。

表3 采用PG 法與CIDH 法比較

表4 移植胚胎數(shù)、胚胎質(zhì)量對(duì)受胎率的影響

表5 胚胎移植結(jié)果

3.2 本次胚胎移植對(duì)供體羊處理采用早晨發(fā)情下午配種，下午發(fā)情第二天早晨配種的辦法，每只羊二次配種，間隔12 h，可能使有些供體羊錯(cuò)過(guò)發(fā)情時(shí)間或發(fā)情沒(méi)有結(jié)束就停止了配種，造成部分卵子沒(méi)有受精。另外，本場(chǎng)杜泊種公羊處于秋季人工授精時(shí)期，采精頻繁，精液品質(zhì)有所下降也是造成部分供體母羊沒(méi)有受精的一重要因素。

3.3 早期胚胎在一定時(shí)間內(nèi)處于游離狀態(tài)、無(wú)排異性等特性是胚胎移植建立的生理基礎(chǔ)，但胚胎移植受孕要求供體和受體種屬上、生理上、胚胎收集和移植部位必須一致，才使胚胎移植成活成為可能。本次移植受體羊處于秋季正常發(fā)情季節(jié)，采用兩次注射PG 法進(jìn)行同期發(fā)情處理，同期率達(dá)84.5%。在同期處理時(shí)受體羊比供體羊提前12 h注射PG 同期性好，移植受胎率高。

3.4 羊的鮮胚移植主要環(huán)節(jié)就是供受體的選擇、供受體繁殖營(yíng)養(yǎng)調(diào)控、供受體的同期發(fā)情、供體超數(shù)排卵(供體打針、胚胎的采集、胚胎的評(píng)定)、胚胎的移植、術(shù)后保健等。在具體工作中要相互銜接，環(huán)環(huán)緊扣，技術(shù)人員必須有很強(qiáng)的專業(yè)理論水平，同時(shí)兼有操作技術(shù)水平，團(tuán)隊(duì)成員之間能夠相互協(xié)作，帶頭人要具有強(qiáng)烈的責(zé)任心、細(xì)心、耐心才能完成。

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