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    心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)細胞的保護作用及其機制研究*

    2015-08-24 07:43:18馬萌萌胡利民王喬悅楊紅云王旭梅
    關(guān)鍵詞:復(fù)氧心腦膜電位

    馬萌萌,胡利民,王喬悅,楊紅云,王旭梅,郭 虹

    (天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院,天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地天津市中藥藥理學(xué)重點實驗室,天津300193)

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    心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)細胞的保護作用及其機制研究*

    馬萌萌,胡利民,王喬悅,楊紅云,王旭梅,郭虹

    (天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院,天津市現(xiàn)代中藥重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地天津市中藥藥理學(xué)重點實驗室,天津300193)

    [目的]研究心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)細胞的保護作用及其機制。[方法]體外培養(yǎng)Neuro-2a細胞,分為正常對照組、缺氧/復(fù)氧損傷模型組、心腦舒通(10、25、50 mg/L)給藥組,建立缺氧缺糖(OGD)4 h/復(fù)氧復(fù)糖(Rep)24 h損傷模型,檢測心腦舒通對各組細胞增殖活力、乳酸脫氫酶(LDH)漏出量、活性氧(ROS)水平和線粒體膜電位(△Ψm)的影響。[結(jié)果]與缺氧/復(fù)氧組比較,心腦舒通可以明顯增加Neuro-2a細胞活力,減少LDH漏出,降低ROS水平,增強線粒體膜電位。[結(jié)論]心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷神經(jīng)細胞具有明顯保護作用,其機制與其影響活性氧水平和線粒體膜電位有關(guān)。

    心腦舒通;神經(jīng)保護;缺氧/復(fù)氧;Neuro-2a細胞

    DOI:10.11656/j.issn.1673-9043.2015.04.14

    心腦舒通為蒺藜植物地上部分有效部位的提取物,其主要成分是蒺藜總皂苷,具有活血化瘀,舒利血脈的藥理作用[1]?,F(xiàn)代研究表明蒺藜皂苷具有抗腫瘤、提高耐缺氧能力、增強免疫功能、保護視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞及中樞神經(jīng)系統(tǒng)、保護心肌、抗腦缺血等作用[2],其中抗腦缺血這一作用與其降低血小板聚集性及抗凝血有關(guān)[3]。臨床研究也證實,心腦舒通可以改善血液流變性,改善缺血性心腦血管組織的供血,對預(yù)防和治療缺血性心腦血管疾病具有良好的應(yīng)用前景[4-7]。但近年來對其藥理研究較少,對其作用機制尚不明確。因此本實驗采用缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細胞模型,初步探討心腦舒通的神經(jīng)保護作用及其可能機制。

    1 材料

    1.1藥物與試劑小鼠腦神經(jīng)瘤細胞株Neuro-2a,北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué);心腦舒通,吉林敖東股份有限公司(批號Z22021965);MEM培養(yǎng)液,Hyclone公司;胎牛血清(FBS),BI公司;Cell Counting Kit(CCK-8),日本同仁化學(xué)研究所;活性氧檢測試劑盒、JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒,上海碧云天生物技術(shù)研究所。

    1.2儀器CO2恒溫培養(yǎng)箱,德國Thermo公司;FlexStation 3多功能酶標儀,美國MD公司;全自動生化分析儀,日本東芝公司。

    2 方法

    2.1Neuro-2a細胞培養(yǎng)與處理Neuro-2a細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清,100 U/mL青霉素,0.1 g/L鏈霉素,2 mmol/L L-谷氨酰胺的MEM完全培養(yǎng)基中。將處于對數(shù)生長期的Neuro-2a細胞消化并吹打成單細胞懸液,調(diào)整細胞密度至每毫升4×105個接種于96孔板中。細胞分組及處理如下:1)正常對照組:將完全培養(yǎng)基替換為MEM培養(yǎng)液,CO2培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)4 h后,替換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。2)缺氧/復(fù)氧損傷模型組:將完全培養(yǎng)基替換為DHank’s平衡鹽溶液,置于充滿95%N2-5%CO2混合氣體的缺氧小室孵育4 h后,置換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。3)心腦舒通給藥組:將完全培養(yǎng)基分別置換為含有不同濃度心腦舒通(10、25、50 mg/L)的D-Hank’s溶液,置于充滿95%N2-5%CO2混合氣體的缺氧小室孵育4 h后,再分別置換為含不同濃度心腦舒通(10、25、50 mg/L)的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

    2.2細胞活力、LDH漏出量檢測細胞分組處理后,收取上清液,全自動生化儀測定上清液中乳酸脫氫酶(LDH)的含量。培養(yǎng)板中每孔加入100 μL含10%CCK-8的MEM培養(yǎng)液,37℃孵育30 min,酶標儀450 nm波長檢測各孔吸光度(A)。

    2.3活性氧水平檢測細胞分組處理后,棄去上清液,細胞用MEM洗滌3次,每孔加入100 μL 1∶1 000稀釋的DCFH-DA,使終濃度為10 μg/L。37℃避光孵育20 min,MEM洗滌細胞3次,酶標儀488 nm激發(fā)波長,525 nm發(fā)射波長測定熒光強度值。

    2.4線粒體膜電位檢測細胞分組處理后,棄去上清液,細胞用MEM洗滌3次,每孔加入100 μL 1∶500稀釋的JC-1,37℃避光孵育20 min,MEM洗滌細胞3次,酶標儀490 nm激發(fā)波長,530 nm發(fā)射波長測定JC-1單體熒光強度值,525 nm激發(fā)波長,590 nm發(fā)射波長測定JC-1聚合物熒光強度值,結(jié)果用JC-1聚合物與JC-1單體熒光強度比值表示。

    2.5統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較若方差齊采用LSD法,若方差不齊用Dunnetts’s T3法,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    3 結(jié)果

    3.1對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細胞活力、LDH漏出量的影響與正常對照組比較,缺氧/復(fù)氧損傷模型組細胞活力明顯降低(P<0.01),LDH漏出量明顯升高(P<0.01)。與模型組比較,心腦舒通25、50 mg/L組可以顯著增加細胞活力(P<0.01),減少LDH漏出量(P<0.05,P<0.01)。結(jié)果見表1。

    表1 心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細胞活力、LDH漏出量的影響(x±s)

    3.2對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細胞活性氧水平、線粒體膜電位的影響與正常對照組比較,缺氧/復(fù)氧損傷模型組活性氧(ROS)水平顯著升高(P<0.05),線粒體膜電位明顯降低(P<0.01)。與模型組比較,心腦舒通10、25、50mg/L組均可顯著降低ROS水平(P< 0.05),且25、50 mg/L組還可明顯增加線粒體膜電位(P<0.05)。結(jié)果見表2。

    表2 心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細胞活性氧、細胞線粒體膜電位水平的影響(±s)

    表2 心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細胞活性氧、細胞線粒體膜電位水平的影響(±s)

    注:與對照組比較,**P<0.01,*P<0.05。與模型組比較,#P<0.05。

    4 討論

    近年來有研究表明,心腦舒通可改善血液流變性、促進腦血循環(huán)及微循環(huán)、防止心腦血管并發(fā)癥,臨床上已經(jīng)廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病及中風(fēng)后遺癥的預(yù)防和治療[8-10]。藥理實驗研究證實,心腦舒通可以改善微管蛋白和微管結(jié)合蛋白的表達,維護細胞骨架的結(jié)構(gòu)[11];有效調(diào)控急性腦缺血再灌注病理過程中的血管新生,促進病理損傷的修復(fù)[12];改善大鼠皮質(zhì)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)如腎上腺素、多巴胺、5-羥色胺的紊亂[13];增高氧化應(yīng)激PC12細胞NF-κB水平;改善AD大鼠空間記憶障礙[14]。腦缺血再灌注損傷還會引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)發(fā)生[15-16],心腦舒通可以降低腦組織和血清內(nèi)白介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量[17],調(diào)控凋亡相關(guān)的蛋白表達,降低腦組織中神經(jīng)細胞的凋亡率[18]。本文探討了心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細胞增殖活力、乳酸脫氫酶(LDH)漏出量、活性氧簇水平和線粒體膜電位(△Ψm)的影響。

    在正常情況下細胞內(nèi)LDH的漏出量很低,但細胞受到損傷后由于細胞膜的通透性發(fā)生了改變,細胞釋放到培養(yǎng)液中的LDH會顯著增多。在腦缺血再灌注損傷過程中神經(jīng)細胞損傷,會產(chǎn)生大量活性氧簇(ROS),ROS包括氧的單電子還原產(chǎn)物(O-、、OH)、氧的雙電子還原物(H2O2)、烷烴過氧化物均裂產(chǎn)物(RO°、ROO°)、處于激發(fā)態(tài)的氧、單線態(tài)氧和羰基化合物等。ROS可滅活細胞內(nèi)重要的酶及蛋白、破壞膜結(jié)構(gòu)使細胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變、直接氧化損傷DNA分子造成細胞損傷[19]。線粒體膜電位下降是細胞凋亡早期的標志之一[20-21]。

    本實驗結(jié)果證實心腦舒通25、50 mg/L組可以明顯增加缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細胞活力、減少LDH漏出量;心腦舒通10、25、50 mg/L組可顯著降低細胞ROS水平;心腦舒通25、50 mg/L組可顯著提高線粒體膜電位。表明心腦舒通對缺氧/復(fù)氧損傷Neuro-2a細胞具有保護作用,其機制與其影響活性氧水平和線粒體膜電位有關(guān),這一結(jié)果為更深入研究心腦舒通的神經(jīng)保護作用奠定了一定基礎(chǔ)。

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    Protective effect of Xinnao Shutong on hypoxia/reoxygenation injured nerve cells and its mechanism

    MA Meng-meng,HU Li-min,WANG Qiao-yue,YANG Hong-yun,WANG Xu-mei,GUO Hong
    (Institute of Traditional Chinese Medicine,Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine,Tianjin Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmacology,Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China)

    [Objective]To study the protective effect of Xinnao Shutong on hypoxia/reoxygenation injured nerve cells and its mechanism.[Methods]Neuro-2a cells were cultured in vitro,divided into control,model,low-dose,mid-dose and high-dose Xinnao Shutong(10、25、50 g/mL)groups.Establishmenting OGD 4 h/Rep 24 h damage model,detecting cell viability,lactate dehydrogenase(LDH)leakage,reactive oxygen species(ROS)level and mitochondrial membrane potential(△Ψm).[Results]Compared with model group Xinnao Shutong can significantly increase the Neuro-2a cell activity,reduce the leakage of LDH,decrease the level of ROS,enhance the mitochondrial membrane potential.[Conclusion]Xinnao Shutong has obvious protective effect on hypoxia/reoxygenation injured nerve cells,and the mechanism is related to influence ROS level and mitochondrial membrane potential on Neuro-2a.

    Xinnao Shutong;neuroprotection;hypoxia/reoxygenation;Neuro-2a

    R285.5

    A

    1673-9043(2015)04-0245-03

    國家科技重大專項項目-重大新藥創(chuàng)制(2011ZX 09201);“十二五”期間天津市高等學(xué)?!皠?chuàng)新團隊培養(yǎng)計劃”(TD12-5035)。

    馬萌萌(1990-),女,碩士研究生,主要從事中藥神經(jīng)藥理研究。

    郭虹,E-mail:cacti1983@163.com。

    (2015-03-14)

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