風寒方對豚鼠咳嗽反射敏感性及肺組織P物質(zhì)水平影響的實驗研究*

談馨媛，林珍珍，吳　蕾，林　琳

（1.廣東省中醫(yī)院，廣州510120；2.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣州510405）

風寒方對豚鼠咳嗽反射敏感性及肺組織P物質(zhì)水平影響的實驗研究*

談馨媛1，林珍珍2，吳蕾1，林琳1

（1.廣東省中醫(yī)院，廣州510120；2.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣州510405）

［目的］評價風寒方對咳嗽反射敏感性影響并探討氣道神經(jīng)源性炎癥的作用靶點。為進一步新藥開發(fā)研究提供一定的實驗依據(jù)。［方法］采用枸櫞酸引咳法建立咳嗽模型豚鼠，按隨機數(shù)字表法隨機分為空白對照組、空白模型組、抗病毒口服液組、風寒方低劑量組、風寒方高劑量組。1周后對各組動物采用小動物體描儀測定豚鼠的咳嗽反射敏感性（CRS），酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定各組豚鼠肺組織勻漿P物質(zhì)（SP）水平。［結(jié)果］與空白模型組比較，風寒方兩組干預組顯示出改善咳嗽反射敏感性的作用（P＜0.05）。抗病毒口服液組、風寒方低劑量組、風寒方高劑量組間比較，SP無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。［結(jié)論］風寒方干預組具有改善咳嗽反射敏感性的作用。

咳嗽；神經(jīng)源性炎癥；風寒方

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.04.09

咳嗽是呼吸科最常見的主訴。但現(xiàn)代醫(yī)學尚缺乏治療亞急性/慢性咳嗽的公認有效的藥物。中醫(yī)診治咳嗽歷史悠久，中醫(yī)藥治療咳嗽尤其是“頑咳”“久咳”具有一定優(yōu)勢［1-4］。本科牽頭完成的“十一五”國家科技支撐計劃結(jié)果顯示風寒方治療風寒戀肺型感染后咳嗽有較良好的療效。本文采用對比干預的研究方法，從咳嗽反射敏感性（CRS）、肺組織勻漿P物質(zhì)（SP）等變化了解風寒方對咳嗽豚鼠的影響，初步評價風寒方治療咳嗽的作用靶點，為新藥開發(fā)提供一點實驗基礎。

1　材料與方法

1.1動物雄性清潔級豚鼠，體質(zhì)量200～300 g。由廣州市花都區(qū)東信華實驗動物養(yǎng)殖場提供，動物許可證號：SCXK（粵）2014-0023。本實驗得到廣東省中醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準，所有的動物實驗操作均依照廣東省中醫(yī)院實驗動物委員會規(guī)定的協(xié)議及相關推薦進行。

1.2中藥風寒方水煎劑（麻黃、苦杏仁、生姜等組成，劑量比例1∶2∶2，將藥材冷水浸泡后煮沸15 min，濾過，煎出液于水浴上濃縮至每1 mL相當于藥材量2 g藥液），抗病毒口服液（廣州香雪制藥股份有限公司生產(chǎn)國藥準字：Z10890017，批號：21302028）。

1.3試劑與儀器辣椒素購自Sigma；P物質(zhì)ELISA檢測試劑盒購自武漢華美公司。單腔非限制型小動物體描儀（型號AUT6100）。超高速低溫離心機（型號：AllegraX-22RCentrifuge），移液器（10μL，100μL，200 μL）

1.4實驗分組及模型制備清潔級雄性豚鼠75只，按隨機數(shù)字表法隨機分為5組：空白對照組、風寒方高劑量組、風寒方低劑量組、抗病毒口服液組、空白模型組。平均每組15只。

枸櫞酸引咳法咳嗽豚鼠模型：將豚鼠放入密閉容器中，用超聲霧化器噴入17.5%枸櫞酸霧化氣霧化5～10 s。見豚鼠出現(xiàn)胸腹收縮運動，并有咳嗽動作或聲音時為造模成功。

1.5給藥方式給藥劑量根據(jù)等效劑量折算法計算：1）空白對照組：生理鹽水2 mL，每日1次，灌胃。2）風寒方低劑量組：中藥水煎劑2 mL，每日1次，灌胃。3）風寒方高劑量組：中藥水煎劑4 mL，每日1次，灌胃。4）抗病毒口服液組：抗病毒口服液2 mL，每日1次，灌胃。5）空白模型組：生理鹽水2mL，每日1次，灌胃。給藥時間4 d。

1.6觀察項目

1.6.1咳嗽反射敏感性（CRS）本研究應用單腔非限制型小動物體描儀來測定豚鼠的CRS，各組動物分別在預定時間進行辣椒素咳嗽激發(fā)實驗，判斷CRS的指標主要是咳嗽總次數(shù)（CCnt）［5］，小動物肺功能系統(tǒng)通過采集氣流變化信號，計算曲線下面積（V2）以及氣流半數(shù)峰值轉(zhuǎn)換時間，經(jīng)過模擬方程換算后判斷是否為咳嗽動作。辣椒素激發(fā)溶液濃度為50 μmol/L，總量為1mL，觀測記錄10 min（含霧化時間）內(nèi)的CCnt。

1.6.2肺組織勻漿P物質(zhì)水平（SP）稱取100mg新鮮豚鼠肺組織，先加0.1 mol/L醋酸0.3 mL，100℃水浴10 min以滅活內(nèi)源性激肽酶活性，然后按比例加入一定量的磷酸鹽緩沖液（PBS），用1～3 mL玻璃勻漿器勻漿，3 500 r/min離心20 min，取上清-70℃保存，或水浴后-70℃保存，用前勻漿。酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測豚鼠肺組織SP的含量。

1.7統(tǒng)計學分析采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)錄入及統(tǒng)計分析，計量資料為偏態(tài)分布，以中位數(shù)（M）四分位數(shù)間距（QR）表示，組間比較采用Kruskal-Wallis法，兩兩比較采用Nemenyi檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較用t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析。

2　結(jié)果

2.1各組豚鼠CRS咳嗽激發(fā)實驗是反映CRS的一個具體指標。與空白模型組比較，風寒方高、低劑量組顯示出改善CRS的作用，與空白對照組、空白模型組比較，有較顯著差異（P＜0.05）。而抗病毒口服液干預組同模型組比較，無統(tǒng)計學差異。風寒方不同劑量組之間CRS值比較亦無統(tǒng)計學差異。見表1。

表1　各組豚鼠CRS比較

2.2各組豚鼠肺組織勻漿P物質(zhì)水平ELISA法檢測豚鼠肺組織SP的含量。各藥物干預組與空白模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義。但風寒方低劑量組及抗病毒口服液組均有改善肺組織神經(jīng)源炎性物質(zhì)釋放的趨勢。見表2。

表2　肺組織勻漿SP含量比較pg/mg

根據(jù)實驗結(jié)果，再次對藥物干預組取材的肺組織勻漿行蛋白濃度滴定，進一步矯正P物質(zhì)（pg/mg）含量。通過蛋白濃度滴定的矯正后，雖然各藥物組間仍沒有統(tǒng)計學差異。但可見抗病毒口服液組及風寒方低劑量組有改善肺組織神經(jīng)源炎性物質(zhì)釋放的趨勢。結(jié)果如表3。

表3　藥物干預組肺組織勻漿SP含量比較（蛋白濃度滴定矯正后）pg/mg

3　討論

目前慢性咳嗽，尤其是感染后咳嗽的機制研究所知甚少，一般認為，咳嗽感受器的CRS異常增高是導致感染后咳嗽機體發(fā)生咳嗽反應十分重要的原因［6-11］。

SP是一種最常見的速激肽，SP及其受體廣泛分布于呼吸系統(tǒng)的氣道上皮，黏膜下腺體、肌細胞、血管等部位，主要由C纖維末梢釋放，是氣道神經(jīng)源性炎癥的核心介質(zhì)。SP參與咳嗽反射的作用已被許多研究證實［12］。而上呼吸道感染后黏膜損傷，神經(jīng)末梢暴露，SP等神經(jīng)肽釋放增高引起神經(jīng)源性炎癥是導致CRS升高的關鍵原因。

中醫(yī)認為，外感咳嗽多是六淫邪氣外侵，肺氣失宣，清肅失常，肺氣不利，痰生氣逆所致［13］。所以外感咳嗽的治療應以透邪為先，宣肅肺氣為主。風寒方以“疏風透邪宣肺止咳”立法，針對感染后咳嗽“外邪襲肺，肺失宣肅”的主要病機特點化裁而制，且經(jīng)過本專科牽頭完成的國家“十一五”科技支撐計劃臨床試驗驗證。

本研究則采用對比干預的研究方法，將風寒方干預組同抗病毒口服液干預組、空白模型組及空白對照組干預的咳嗽模型豚鼠進行對照，結(jié)果顯示：風寒方干預能改善咳嗽豚鼠的CRS：無論是風寒方低劑量組還是風寒方高劑量組，與空白模型組比較，組間均有統(tǒng)計學差異。雖然不同劑量組之間CRS值比較無統(tǒng)計學差異，但在今后的實驗中增加動物實驗例數(shù)或可發(fā)現(xiàn)變化趨勢。風寒方干預有改善肺組織神經(jīng)源炎性物質(zhì)釋放的趨勢：雖然風寒方高劑量、低劑量、抗病毒口服液與空白模型組相比，均未能明顯改善豚鼠肺組織勻漿的SP含量。無論是蛋白濃度滴定矯正前還是矯正后，均可見風寒方低劑量組及抗病毒口服液組有改善肺組織神經(jīng)源炎性物質(zhì)釋放的趨勢。今后增加動物實驗例數(shù)或可進一步發(fā)現(xiàn)變化趨勢。

本研究雖然受實驗經(jīng)費、實驗周期、實驗動物例數(shù)、實驗經(jīng)驗等多方面的限制，未能得出明確的陽性結(jié)果，但結(jié)論仍可以提示，風寒方有改善豚鼠CRS的作用，其作用靶點可能是降低肺組織神經(jīng)源性炎癥釋放。

［1］陳如沖，賴克方，劉春麗，等.廣州地區(qū)1087名大學生咳嗽的流行病學調(diào)查［J］.中華流行病學雜志，2006，27（2）：123-126.

［2］Pratter MR，Bartter T，Akers S，et al.An algorithmic approach to chronic cough［J］.Ann Intern Med.1993，119（10）：977-983.

［3］Schroeder Kl，F(xiàn)ahey T.Systematic review of randomised controlled trials of over the counter cough medicines for acute cough in adults［J］.BMJ.2002，324（7333）：329-331.

［4］吳蕾，許銀姬，林琳.中醫(yī)藥辨治感冒后咳嗽的臨床研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，21（7）：1738-1739.

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［6］葉新民，鐘南山，劉春麗，等.呼吸道合胞病毒感染對豚鼠咳嗽相關氣道功能及其神經(jīng)遞質(zhì)的影響［J］.中華哮喘雜志（電子版），2011，5（3）：31-34.

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［12］葉新民，劉春麗，鐘南山，等.感染后咳嗽及其神經(jīng)源性炎癥機制研究進展［J］.中華哮喘雜志（電子版），2010，4（5）：317-319.

［13］張建芬.淺談外感咳嗽的治療［J］.天津中醫(yī)藥大學學報，2010，21（3）：29-30.

Study of the changes of Fenghan Fang on cough reflex sensitivity and substance P content in lung homogenates in cough guinea pigs

TAN Xin-yuan1，LIN Zhen-zhen2，WU Lei1，LIN Lin1
（1.Guangdong Province Traditional Chinese Medical Hospital，Guangzhou 510120，China；2.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

［Objective］To investigate the changes of cough reflex sensitivity and airway neurogenic mechanism in cough guinea pigs of Fenghan Fang’s influence.Then we can discovery the target point of treatment and make foundation for new medicine.［Methods］Guinea pigs cough test induced by citric acid were randomly divided into normal control group and the model group，the Peroral Liquids of Kangbingdu group，the low dose of Fenghan Fang control group，the high dose of Fenghan Fang control group.The plethysmograph was used to assess cough reflex sensitivity.Substance P（SP）content in lung homogenates was assayed by ELISA.［Results］The CRS of Fenghan Fang control groups were significantly lower than that in control group（P＜0.05）.The SPA was no statistically significant differences in Peroral Liquids of Kangbingdu group，and two groups of Fenghan Fang controled（P＞0.05）.［Conclusion］Fenghan Fang can reduce cough guinea pigs's CRS.

Cough；Neuogenic inflammation；Fenghan Fang

R285.5

A

1673-9043（2015）04-0226-03

廣東省中醫(yī)藥局（粵中醫(yī)［2013］17號）；2013年建設中醫(yī)藥強省資助項目（20131177）。

談馨媛（1981-），女，碩士，主治醫(yī)師，研究方向為慢性阻塞肺疾病和慢性咳嗽的中醫(yī)藥治療。

（2015-04-21）