補(bǔ)骨脂酚對(duì)小鼠肝功能和膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體BSEP、NTCP的影響*

畢亞男，李　震，周　昆，趙雪言，史　紅，鄭　林

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

·實(shí)驗(yàn)研究·

補(bǔ)骨脂酚對(duì)小鼠肝功能和膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體BSEP、NTCP的影響*

畢亞男1，李震2，周昆1，趙雪言1，史紅1，鄭林1

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，方劑學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

［目的］觀察補(bǔ)骨脂酚對(duì)小鼠肝功能和膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體膽鹽輸出泵（BSEP）、鈉?；撬崮懰峁厕D(zhuǎn)移蛋白（NTCP）的影響。［方法］小鼠連續(xù)14 d皮下注射50 mg/kg補(bǔ)骨脂酚和10 mg/kg α-雌二醇，分別在給藥1、3、7、14 d后處死部分小鼠取材，檢測(cè)血清生化，剖取肝臟稱質(zhì)量并進(jìn)行肝臟病理組織學(xué)檢查，取新鮮肝臟用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）檢測(cè)BSEP、NTCP的蛋白表達(dá)。［結(jié)果］補(bǔ)骨脂酚和α-雌二醇對(duì)小鼠體質(zhì)量沒有明顯影響。α-雌二醇皮下注射14 d會(huì)使小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALP）升高、肝臟腫大、肝系數(shù)升高，而補(bǔ)骨脂酚無(wú)此作用，但給藥期間補(bǔ)骨脂酚可導(dǎo)致血清ALP一過性降低，14 d時(shí)恢復(fù)正常。補(bǔ)骨脂酚對(duì)肝臟BSEP基本沒有影響，而會(huì)導(dǎo)致NTCP逐漸升高，給藥14 d時(shí)NTCP顯著高于溶劑組。給藥14 d，補(bǔ)骨脂酚組小鼠肝臟無(wú)病變，而α-雌二醇組小鼠肝臟存在肝細(xì)胞變性。［結(jié)論］50 mg/kg補(bǔ)骨脂酚給藥14 d未見肝臟毒性，而10 mg/kg α-雌二醇肝毒性明顯。

補(bǔ)骨脂酚；小鼠；膽鹽輸出泵；鈉?；撬崮懰峁厕D(zhuǎn)移蛋白

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.04.08

補(bǔ)骨脂酚是補(bǔ)骨脂中含量最高的成分，屬于單萜酚類成分在藥材中含量為1.12%～5.149%［1-2］，占揮發(fā)油的60%以上［3］，遠(yuǎn)大于補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素0.4%的含量水平［4-5］。有研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂酚對(duì)KH-2細(xì)胞有顯著毒性［6］，而課題組前期研究也表明補(bǔ)骨脂酚對(duì)HepG2細(xì)胞也有明顯毒性，自2005年開始有多起報(bào)道補(bǔ)骨脂引起的肝損害［7-9］，實(shí)驗(yàn)室有結(jié)果顯示補(bǔ)骨脂對(duì)肝臟會(huì)造成損傷［10-13］，那么補(bǔ)骨脂酚是否會(huì)與補(bǔ)骨脂的肝毒性有關(guān)，報(bào)道中補(bǔ)骨脂引起的肝損害多有膽汁淤積的表現(xiàn)，可能與其影響了膽汁酸的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，這與雌激素引起的肝損害很相似［14］。本研究在ICR小鼠連續(xù)皮下注射給予觀察補(bǔ)骨脂酚對(duì)小鼠肝功能和肝臟中膽鹽輸出泵（BSEP，ABCB11）、鈉?；撬崮懰峁厕D(zhuǎn)移蛋白（NTCP，SLC10A1）表達(dá)的影響，并設(shè)了α-雌二醇作為陽(yáng)性對(duì)照，初步考察補(bǔ)骨脂酚的毒性及其對(duì)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體是否有影響。

1　材料

1.1受試藥補(bǔ)骨脂酚，經(jīng)高效液相色譜法（HPLC）檢測(cè)純度＞95%，購(gòu)自天津月牙湖科技有限公司。

1.2細(xì)胞ICR小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0004。

1.3試劑與儀器α-雌二醇（TCI），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、膽汁酸（TBA）全自動(dòng)生化儀檢測(cè)試劑盒（Biosino），BCA蛋白測(cè)定試劑盒（Beyotime），BSEP和NTCP試劑盒（Cusabio），1，2丙二醇（天津市江天化學(xué)技術(shù)有限公司），生理鹽水（辰欣藥業(yè)）。

Legend Micro17離心機(jī)為Thermo公司產(chǎn)品，7020全自動(dòng)生化儀為日立公司產(chǎn)品，脫水切片機(jī)均為L(zhǎng)ecia公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡為Olympus產(chǎn)品，InfiniteM200多功能酶標(biāo)儀為Tecan公司產(chǎn)品。

2　方法

2.1動(dòng)物分組及給藥100只小鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，即對(duì)照組10只、溶劑組40只，補(bǔ)骨脂酚50 mg/kg組40只，α-雌二醇10 mg/kg組10只。參照文獻(xiàn)中雌二醇的給藥方式［14］，補(bǔ)骨脂酚和α-雌二醇在實(shí)驗(yàn)前用溶劑（80%的1，2丙二醇生理鹽水液）進(jìn)行溶解后供皮下注射使用。各組每日按5 mL/kg皮下注射給藥1次，對(duì)照組以飲用水灌胃，連續(xù)14 d。

2.2小鼠肝功能、病理組織學(xué)及BSEP和NTCP的檢測(cè)分別在1、3、7 d給藥結(jié)束，各取溶劑組和補(bǔ)骨脂酚組小鼠各10只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，剩余小鼠在給藥14 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食不禁水12 h，自眼眶取血，3 000 r/min離心分離血清，檢測(cè)血清中ALT、AST、ALP、TBA。取相同部位肝臟一葉，用12%甲醛液固定，常規(guī)石蠟包埋、蘇木精-伊紅染色（HE），光鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。取新鮮肝臟用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）制備肝勻漿并檢測(cè)總蛋白濃度，將肝勻漿稀釋適當(dāng)倍數(shù)，參照酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒說明書，檢測(cè)小鼠肝臟中BSEP、NTCP蛋白濃度。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3　結(jié)果

3.1補(bǔ)骨脂酚皮下注射不同時(shí)間對(duì)小鼠體質(zhì)量及肝臟的影響補(bǔ)骨脂酚和α-雌二醇連續(xù)給藥對(duì)小鼠體質(zhì)量沒有明顯的影響，補(bǔ)骨脂酚和α-雌二醇連續(xù)給藥14 d小鼠體質(zhì)量與溶劑組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見表1。連續(xù)給藥14 d，補(bǔ)骨脂酚對(duì)小鼠肝系數(shù)并無(wú)顯著影響，而α-雌二醇組小鼠肝系數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），見圖1。

表1　給藥不同時(shí)間小鼠體質(zhì)量的變化（±s）g

表1　給藥不同時(shí)間小鼠體質(zhì)量的變化（±s）g

?

圖1　給藥14 d小鼠肝系數(shù)

補(bǔ)骨脂酚50 mg/kg連續(xù)給藥期間，小鼠血清中ALP有一過性降低，在給藥3 d和7 d均顯著低于溶劑組，14 d補(bǔ)骨脂酚組小鼠ALP與溶劑組并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而α-雌二醇10 mg/kg連續(xù)給藥14 d，可使小鼠血清ALP顯著升高。血清中AST、ALT和TBA的變化并不顯著，見表2-5。

連續(xù)給藥14 d，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞排列整齊，肝索清晰，肝細(xì)胞無(wú)變性壞死。溶劑組小鼠肝臟無(wú)明顯病理變化。補(bǔ)骨脂酚組小鼠肝臟肝索清晰，未見明顯病理改變，而α-雌二醇組小鼠可見肝臟的肝小葉中央?yún)^(qū)域肝細(xì)胞明顯腫脹變性、排列紊亂，見圖2。

圖2　給藥14 d典型病理照片（HE染色×200）

表2　給藥不同時(shí)間血清AST的變化（±s）U/L

表2　給藥不同時(shí)間血清AST的變化（±s）U/L

組別劑量n給藥時(shí)間（mg/kg）1 d3 d7 d14 d對(duì)照組-10---173.8±42.6溶劑組-10 153.0±46.7166.5±40.6 165.8±44.0 214.2±44.9補(bǔ)骨脂酚組5010 153.5±41.5159.1±50.3 197.7±67.5 191.3±51.4 α-雌二醇組1010---183.3±61.8

表3　給藥不同時(shí)間血清ALT的變化（±s）U/L

表3　給藥不同時(shí)間血清ALT的變化（±s）U/L

組別劑量n給藥時(shí)間（mg/kg）1 d3 d7 d14 d對(duì)照組-10---173.8±42.6溶劑組-10 31.2±05.2 50.3±29.1 38.9±14.4 214.2±44.9補(bǔ)骨脂酚組5010 30.5±10.8 34.6±09.6 35.9±05.9 191.3±51.4 α-雌二醇組1010---183.3±61.8

表4　給藥不同時(shí)間血清ALP的變化（±s）U/L

表4　給藥不同時(shí)間血清ALP的變化（±s）U/L

注：與溶劑組比較，**P＜0.01，*P＜0.05。

組別劑量n給藥時(shí)間（mg/kg）1 d3 d7 d14 d對(duì)照組-10---123.1±22.4溶劑組-10 168.6±56.1 130.3±31.7158.6±53.1 108.0±38.2補(bǔ)骨脂酚組5010 125.9±36.8 84.0±19.3**111.6±25.7*115.0±33.4 α-雌二醇組1010---252.9±50*

表5　給藥不同時(shí)間血清TBA的變化（±s）μmol/L

表5　給藥不同時(shí)間血清TBA的變化（±s）μmol/L

組別劑量n給藥時(shí)間（mg/kg）1 d3 d7 d14 d對(duì)照組-10---26.00±10.98溶劑組-10 21.88±4.70 19.23±9.64 23.64±13.70 30.02±21.00補(bǔ)骨脂酚組5010 19.43±8.78 22.41±9.99 17.27±6.29 22.63±14.20 α-雌二醇組1010---21.90±12.30

3.2補(bǔ)骨脂酚皮下注射不同時(shí)間對(duì)BSEP和NTCP的影響補(bǔ)骨脂酚50 mg/kg連續(xù)皮下注射14 d小鼠，小鼠肝臟中BSEP蛋白表達(dá)變化并不明顯，給藥1、3、7、14 d與溶劑組均無(wú)顯著差異；而NTCP蛋白表達(dá)隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)有升高的趨勢(shì)，給藥14 d時(shí)顯著高于溶劑組（P＜0.05），見圖3。

圖3　給藥不同時(shí)間肝臟BSEP和NTCP蛋白表達(dá)

4　討論

已經(jīng)有多個(gè)研究證實(shí)補(bǔ)骨脂酚在體外有十分明顯的細(xì)胞毒性，對(duì)于HepG2、A549、MCF-7、DU-145、THP-1等多個(gè)腫瘤細(xì)胞增殖有顯著抑制作用［15-17］，而在體內(nèi)卻基本沒有抗腫瘤研究報(bào)道，同時(shí)補(bǔ)骨脂酚的體內(nèi)安全性研究沒有報(bào)道，這可能是因?yàn)檠a(bǔ)骨脂酚的生物利用度很低的原因［18］。筆者沒有觀察到補(bǔ)骨脂酚對(duì)小鼠有明顯的肝毒性表現(xiàn)，有研究認(rèn)為補(bǔ)骨脂酚可以減輕四氯化碳（CCl4）等造成的肝損害［19］，但其保護(hù)機(jī)制尚不明了。

50 mg/kg補(bǔ)骨脂酚給藥14 d，沒有明顯影響B(tài)SEP，但NTCP卻顯著升高了。BSEP和NTCP是肝細(xì)胞膜上最重要的兩個(gè)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，BSEP將膽汁酸由肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞間膽管，NTCP將膽汁酸從血液轉(zhuǎn)運(yùn)至肝細(xì)胞，在非膽道系統(tǒng)出現(xiàn)機(jī)械性梗阻的情況下，這兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的變化很大程度上影響著血液和肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸的平衡，單純的NTCP升高可能致使肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸濃度異常升高。膽汁酸由肝細(xì)胞合成分泌，通過各級(jí)管道最終分泌到十二指腸，幫助進(jìn)行脂肪消化，膽汁酸性極強(qiáng)，在細(xì)胞內(nèi)濃度過高可通過線粒體介導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致毒性產(chǎn)生［20］。補(bǔ)骨脂酚影響了小鼠肝臟內(nèi)膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)，使肝細(xì)胞內(nèi)存在膽汁酸濃度過高的可能，但病理檢查并未發(fā)現(xiàn)病變，這可能是肝細(xì)胞膜上其他轉(zhuǎn)運(yùn)體也同時(shí)發(fā)生改變，最終肝細(xì)胞內(nèi)膽汁酸處于一個(gè)比較穩(wěn)定的水平，也可能是因?yàn)檠a(bǔ)骨脂酚作用時(shí)間較短，未能體現(xiàn)出明顯毒性。

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Influence of Bakuchiol on liver function and bile acid transporters BSEP and NTCP in mouse

BI Ya-nan1，LI Zhen2，ZHOU Kun1，ZHAO Xue-yan1，SHI Hong1，ZHENG Lin1
（1.Institute of Traditional Chinese Medicine，Ministry of Education Key Laboratory of Traditional Chinese Medical Formulae，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe the influence of bakuchiol on liver function and bile acid transporters in mice.［Methods］Mice were treated with 50 mg/kg Bakuchiol and 10 mg/kg-estradiol continuously for 14 d.At 1，3，7 and 14 d，mice were divided into several parts to kill.The material from mice killed was for serum biochemical indicators testing.Then mice livers were taken weight and carry on the liver histologic examination and take fresh liver to detect BSEP，NTCP protein expression with ELISA method.［Results］Bakuchiol and α-estradiol had no significant effect on body weight in mice.The subcutaneous injection of α-estradiol for 14 d made mice elevated serum ALP，hepatomegaly，liver coefficient increased，but the Bakuchiol didn't.ALP decreased for the time of the Bakuchiol injection，after 14 d back to normal.Bakuchiol had no effect on the liver BSEP mostly，and would result in higher NTCP gradually，for 14 d NTCP group was significantly higher than the solvent.After 14 d treatment，Bakuchiol groups of mice liver lesions，and α-estradiol group mice liver had cell degeneration.［Conclusion］Bakuchiol treatment for 14 d does not induce liver injury，but hepatotoxicity of α-estradiol is obvious.

Bakuchiol；mice；BSEP；NTCP

R285.5

A

1673-9043（2015）04-02222-04

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202991）。

畢亞男（1987-），女，碩士研究生，主要從事中藥藥理學(xué)研究工作。

周昆，E-mail：z.k.ken@263.net。

（2015-03-19）