miR-125b、miR-29a和miR-155-5p作為診斷結(jié)核性腦膜炎生物標(biāo)志的研究

柴璐璐，田宋新，袁俐，王宏△

診斷技術(shù)

miR-125b、miR-29a和miR-155-5p作為診斷結(jié)核性腦膜炎生物標(biāo)志的研究

柴璐璐1，田宋新1，袁俐2，王宏1△

目的 探討結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液及血漿中microRNA（miR）-125b、miR-29a和miR-155-5p的表達(dá)水平及其臨床意義。方法 收集20例結(jié)核性腦膜炎患者（結(jié)腦組）和20例原發(fā)性頭痛患者（對(duì)照組）的腦脊液和血漿，分別提取總RNA，使用實(shí)時(shí)定量PCR方法分別檢測(cè)腦脊液和血漿中miR-125b、miR-29a及miR-155-5p的表達(dá)水平。結(jié)果 與對(duì)照組相比，結(jié)腦組腦脊液、血漿中miR-29a、miR-125b表達(dá)水平明顯上調(diào)，結(jié)腦組血漿中miR-155-5p表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），而2組腦脊液中miR-155-5p表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 miR-125b、miR-29a和miR-155-5p可能參與了調(diào)節(jié)結(jié)核性腦膜炎的發(fā)生、發(fā)展過程，miR-125b 和miR-29a有可能作為潛在的診斷結(jié)核性腦膜炎的生物學(xué)標(biāo)志。

結(jié)核，腦膜；血漿；腦脊髓液；微RNAs；實(shí)時(shí)定量PCR；miR-125b；miR-29a；miR-155-5p

結(jié)核性腦膜炎簡(jiǎn)稱結(jié)腦（tuberculous meningitis，TBM），起病多隱匿、病程長(zhǎng)，臨床表現(xiàn)及實(shí)驗(yàn)室檢查缺乏特異性，由于抗菌藥物濫用，導(dǎo)致不典型病例日益增多，診治時(shí)機(jī)延誤，造成較高的致死率及致殘率。目前TBM的診斷主要依賴病原體檢測(cè)，存在周期長(zhǎng)、靈敏度及特異度低等問題，探索TBM的新型、快速診斷方法尤為重要。近年來體液中的微RNAs（microRNAs，miRNAs）作為一種新型的疾病診斷標(biāo)志物已有大量研究報(bào)道，并顯示出良好的應(yīng)用前景［1］。肺結(jié)核患者血清［2］、血漿［3］、痰液［4］及細(xì)胞內(nèi)［5］miRNAs表達(dá)的研究多見報(bào)道，結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液和血漿中相關(guān)miRNAs是否存在表達(dá)差異尚少見報(bào)道。本研究通過檢測(cè)miR-125b、miR-29a和miR-155-5p在結(jié)核性腦膜炎患者與對(duì)照者的腦脊液和血漿中的表達(dá)水平，探討其是否存在差異，及其作為結(jié)核性腦膜炎診斷標(biāo)志物的可能性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 患者來自于2013年10月—2014年6月就診于新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、石河子市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科及伊犁哈薩克族自治州奎屯醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的患者。（1）結(jié)腦組：符合結(jié)腦臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，均經(jīng)結(jié)核DNA檢測(cè)或結(jié)核感染T細(xì)胞檢測(cè)試劑盒（T-SPOT.TB）檢測(cè)陽性，診斷明確的患者20例，有結(jié)核病史4例，其中2例空洞性肺結(jié)核和2例脊柱結(jié)核；排除結(jié)核病外有其他合并癥者。（2）對(duì)照組：原發(fā)性頭痛患者20例，體格檢查未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)陽性體征，腦脊液及相關(guān)輔助檢查各項(xiàng)指標(biāo)均于正常值范圍的住院患者。本研究方案經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，所有患者均簽署知情同意書。2組一般情況比較見表1。

Tab.1 Comparison of general data between two groups表1 2組一般資料比較 （n=20）

1.2 主要材料和儀器 7500Fast熒光定量檢測(cè)儀（AB公司），TC3000PCR儀（英國(guó)Techne公司），GelDoc2000凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó) Bio-RAD公司），紫外分光光度計(jì) Nanodrop2000，miRNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒、miRNA引物（均為Tiangen公司）。氯仿、核酸染料、PBS、無Rnase酶槍頭及離心管購自上海生物工程有限公司，無水乙醇購自天津市登科化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本的收集和處理 抽取研究對(duì)象外周靜脈血3 mL，EDTAK2抗凝，無菌腰穿收集腦脊液3 mL，樣本采集后4 h內(nèi)離心，取上清液至無酶凍存管，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血漿和腦脊液RNA提取 按照miRcute miRNA提取試劑盒說明書提取血漿和腦脊液總RNA。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄 按照Tiangen miRcute miRNA cDNA第1鏈合成試劑盒，先采用miRNA3′末端加多聚A尾poly（A）的方法進(jìn)行miRNA修飾，反應(yīng)體系為20 μL，總RNA4.6 μL，E.coli Poly（A）Polymerase 0.4 μL，10×Poly（A）Polymerase Buffer 2 μL，5×rATP Solution 4 μL，RNase-Free ddH2O 9 μL，短暫離心后在37℃反應(yīng)60 min。然后使用Oligo（dT）-Universal Tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)液的配制（20 μL）：Poly （A）反應(yīng)液2 μL，10×RT Primer 2 μL，10×RT Buffer 2 μL，Super Pure dNTP 1 μL，RNasin（40 U/μL）1 μL，Quant RTase 0.5 μL，RNase-Free ddH2O 11.5 μL。短暫離心后37℃反應(yīng)60 min；最終生成miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第1鏈，置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 熒光定量PCR檢測(cè) 按照Tiangen公司的熒光定量檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作；以U6為內(nèi)參，hsa-miR-125b、hsa-miR-29a、hsa-miR-155-5p及內(nèi)參引物均為Tiangen公司專利；下游引物為通用引物，來自試劑盒。實(shí)時(shí)定量PCR 在AB公司的7500Fast熒光定量檢測(cè)儀上進(jìn)行。PCR的結(jié)果采用相對(duì)定量法2-△△ct值進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。計(jì)量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）描述，組間比較用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布用M（P25，P75）描述，組間比較用兩獨(dú)立樣本比較的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組血漿miR-125b、miR-29a和miR-155-5p表達(dá)水平比較 結(jié)腦組血漿miR-125b、miR-29a和miR-155-5p表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

Tab.2 Expression levels of plasma miR-125b，miR-29a and miR-155-5p in two groups表2 2組血漿miR-125b、miR-29a和miR-155-5p表達(dá)水平比較 ［n=20，M（P25，P75）］

2.2 2組腦脊液miR-125b、miR-29a和miR-155-5p表達(dá)水平比較 結(jié)腦組腦脊液中miR-125b和miR-29a的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），2組腦脊液中miR-155-5p的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

Tab.3 Expression levels of CSF miR-125b，miR-29a and miR-155-5p in two groups表3 2組腦脊液miR-125b、miR-29a和miR-155-5p表達(dá)水平比較 ［n=20，M（P25，P75）］

3 討論

結(jié)核性腦膜炎是肺外結(jié)核中危害最大的類型，隨著結(jié)核病發(fā)病率的升高，結(jié)核性腦膜炎的發(fā)病率也明顯升高，其病死率較高，常遺留永久性中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［7］。當(dāng)機(jī)體處于疾病狀態(tài)下（如感染性疾?。r(shí) miRNAs表達(dá)譜會(huì)發(fā)生特征性的改變。Creemers等［8］研究表明，miRNAs能夠游離于細(xì)胞之外，穩(wěn)定存在于體液（如血清、血漿和腦脊液等）中，循環(huán)miRNAs具有組織特異性、穩(wěn)定性良好，檢測(cè)方便等優(yōu)勢(shì)。

miRNA是一類由小分子非編碼的RNA，能誘導(dǎo)mRNA的降解或抑制其編碼蛋白的翻譯，從而調(diào)節(jié)特異性蛋白的表達(dá)水平［9］。miRNAs在抗結(jié)核感染免疫中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［3，10］。有研究表明，miR-29a，miR-125b和miR-155可能是肺結(jié)核病新型診斷標(biāo)志物［11］。其可能的機(jī)制如下：（1）miR-125b通過抑制Toll樣受體2（TLR2）介導(dǎo)的p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK-p38）/3-磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB）等信號(hào)通路減少腫瘤壞死因子（TNF）-α的合成［12］；同時(shí)TNF-α是miR-125b的靶基因之一，miR-125b直接靶向TNF-α mRNA 的3′UTR，抑制mRNA轉(zhuǎn)錄，高表達(dá)的miR-125b抑制了TNF-α的合成［13］；這均有利于結(jié)核分枝桿菌的生存。（2）miR-29a是Wnt信號(hào)通路中T細(xì)胞因子（T-cell factor，TCF）的負(fù)調(diào)控分子，miR-29a通過靶向降解干擾素（IFN）-γ，高表達(dá)的miR-29a下調(diào)了IFN-γ的合成，抑制機(jī)體對(duì)胞內(nèi)病原體的免疫反應(yīng)［14］；miR-29a還可以通過抑制巨噬細(xì)胞凋亡相關(guān)的半胱天冬酶-3（caspase-3），抑制巨噬細(xì)胞的凋亡過程。（3）Wu等［5］研究證實(shí)感染結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞內(nèi)存在miR-155的高表達(dá)；Ghorpade等［15］研究證明，敲除小鼠巨噬細(xì)胞的miR-155基因可導(dǎo)致與巨噬細(xì)胞凋亡相關(guān)的caspase-3和BRI相關(guān)激酶1（BAK1）表達(dá)下降，從而增加巨噬細(xì)胞的凋亡，有力地證明了miR-155在結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的過程中起著重要作用。本研究熒光定量PCR結(jié)果顯示：（1）結(jié)腦組血漿中miR-125b、miR-29a和miR-155-5p表達(dá)上調(diào)，與Yi等［4，10］和Fu等［3］在活動(dòng)性肺結(jié)核患者的痰液、血清標(biāo)本中miR-29a上調(diào)的趨勢(shì)一致，分別與Rajaram等［13］和Wu等［5］在結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞和單個(gè)核細(xì)胞的研究中miR-125b和miR-155的高表達(dá)一致；推測(cè)miR-125b、miR-29a和miR-155-5p可能參與調(diào)節(jié)結(jié)核性腦膜炎的感染過程。（2）結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液中miR-125b和miR-29a表達(dá)上調(diào)，腦脊液中miR-155-5p的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；因此推測(cè)miR-29a和miR-125b可能作為潛在的結(jié)核性腦膜炎診斷標(biāo)志物。miR-29a和miR-125b能否真正作為結(jié)核性腦膜炎的診斷標(biāo)志物，血漿中miR-29a，miR-125b和miR-155-5p的診斷價(jià)值能否等同腦脊液中的診斷價(jià)值，還需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步的研究。

綜上，miR-125b、miR-29a和miR-155-5p可能參與調(diào)節(jié)了結(jié)核性腦膜炎的發(fā)生、發(fā)展過程，miR-29a和miR-125b可能是潛在的結(jié)核性腦膜炎的生物學(xué)標(biāo)志。然而目前miRNAs在結(jié)核的診斷中尚處于研究階段，其在結(jié)核性腦膜炎的感染過程中的作用機(jī)制及診斷價(jià)值有待于進(jìn)一步的研究。

［1］Bai HX，Pan J.Diagnosis progress on detection of the microRNAs in body fluids［J］.International Journal of Laboratory Medicine，2012，33 （7）:836-839.［拜紅霞，潘杰.體液中微小RNA檢測(cè)用于疾病診斷的進(jìn)展［J］.國(guó)際檢驗(yàn)學(xué)雜志，2012，33（7）:836-839］.doi:10.3969/j.issn.1673-4130.2012.07.030.

［2］Qi Y，Cui L，Ge Y，et al.Altered serum microRNAs as biomarkers for the early diagnosis of pulmonary tuberculosis infection［J］.BMC Infect Dis，2012，12:384.doi:1186/1471-2334-12-384.

［3］Fu Y，Yi Z，Wu X，et al.Circulating microRNAs in patients with active pulmonary tuberculosisinfection［J］.J Clin Microbiol，2011，49 （12）:4246-4251.doi:10.1128/JCM.05459-11.

［4］Yi Z，F(xiàn)u Y，Ji R，et al.Altered microRNA signatures in sputum of patients with active pulmonary tuberculosis［J］.PLoS One，2012，7（8）: e43184.doi:10.1371/journal.pone.0043184.

［5］Wu J，Lu C，Diao N，et al.Analysis of microRNA expression profiling identifies miR-155 and miR-155*as potential diagnostic markers for active tuberculosis:a preliminary study［J］.Hum Immunol，2012，73 （1）:31-37.doi:10.1016/j.humimm.2011.10.003.

［6］Thwaites GE，van Toorn R，Schoeman J.Tuberculous meningitis: more questions，still too few answers［J］.Lancet Neurol，2013，12（10）: 999-1010.doi:10.1016/S1474-4422（13）70168-6.

［7］Joosten AA，Van Der Valk P，Geelen JAG，et al.Tuberculous meningitis:pitfallsin diagnosis［J］.Acta Neurol Scand，2000，102（6）:388-394.doi:10.1034/j.1600-0404.2000.102006388.x.

［8］Creemers EE Tijsen AJ，Pinto YM.Circulating microRNAs novel biomarkers and extracellular communicators in cardiovascular disease［J］.Circ Res，2012，110（3）:483-495.doi:10.1161/CIRCRESAHA.111.247452.

［9］Bartel DP.microRNAs:genomics，biogenesis，mechanism and function ［J］.Cell，2004，116（2）:281-297.doi:10.1016/S0092-8674（04）00045-5.

［10］Zhang YZ，Yi ZJ，F(xiàn)u YR.Research progress on microRNAs and pulmonary infection［J］.Chin J Mol Immunol，2012，28（11）:1223-1224.［張玉芝，伊正君，付玉榮.microRNA與肺部感染的研究進(jìn)展［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2012，28（11）:1223-1224］.

［11］Singh PK，Singh AV，Chauhan DS.Current understanding on microRNAs and its regulation in response to mycobacterial infection［J］.J Biomed Sci，2013，20（1）:14.doi:10.1186/1423-0127-20-14.

［12］Brook M，Tchen CR，Santalucia T，et al.Posttranslational regulation of tristetraprolin subcellularlocalization and protein stability by p38 mitogen-activated protein kinase and extracellular signalregulated kinase pathways［J］.Mol CellBiol，2006，26（6）:2408- 2418.doi: 10.1128/MCB.26.6.2408-2418.2006.

［13］Rajaram MVS，Ni B，Morris JD，et al.Mycobaterium tuberculosis lipomannan blocks TNF biosynthesis by regulating macrophage MAPK-activated protein kinase 2（MK2）and microRNA-125b［J］.Proc Natl Acad，2011，108（42）:17408-17413.doi:10.1073/pnas.1112660108.

［14］Ma F，Xu S，Liu X，et al.The microRNA miR-29 controls innate andadaptive immune responses to intracellular bacterial infection by targeting interferon-γ［J］.NatImmunol，2011，12（9）:861-869.doi: 10.1038/ni.2073.

［15］Ghorpade DS，Leyland R，Kurowska-Stolarska M，et al.MicroRNA-155 is required for Mycobaterium bovis BCG-mediated apoptosis of marcrophages［J］.Mol Cell Bio，2012，32（12）:2239-2253.doi:10.1128/ MCB.06597-11.

（2014-11-28收稿 2015-01-21修回）

（本文編輯 李國(guó)琪）

Study of miR-125b，miR-29a and miR-155-5p as biomarkers of tuberculous meningitis

CHAI Lulu1，TIAN Songxin1，YUAN Li2，WANG Hong1△
1 Department of Neurology，the First Affiliated Hospital，Medicine School of Shihezi University，Shihezi 832000，China；
2 Department of Pathogenic Microbiology and Immunology，Medicine School of Shihezi University
△Corresponding Author E-mail:wang832000@sina.com

Objective To investigate the expression levels of microRNA（miR）-125b，miR-29a and miR-155-5p in cerebrospinal fluid（CSF）and plasma from the patients with tuberculous meningitis and their clinic significance.Methods Cerebrospinal fluid and plasma samples were collected from 20 patients with tuberculous meningitis（tuberculous meningitis group）and 20 patients suffered from primary headache（control group）.The total RNAs were extracted.The levels of miR-125b，miR-29a and miR-155-5p were determined by real-time quantitative PCR（q-PCR）.Results Levels of miR-29a and miR-125b in both CSF and plasma of patients in tuberculous meningitis group were significantly higher than those in patients from control group with statistical significance（P＜0.01）.Mean time，the level of miR-155-5p in plasma but not in CSF of patients in tuberculous meningitis group was higher than those in control group with statistical significance（P＜0.01）.Conclusion Expression of miR-125b，miR-29a and miR-155-5p may participate in regulating the occurrence and development of tuberculous meningitis.And miR-125b and miR-29a may be used as potential biomarkers for diagnosing tuberculous meningitis.

tuberculosis，meningeal；plasma；cerebrospinal fluid；microRNAs；real-time quantitative PCR；miR-125b；miR-29a；miR-155-5p

R529.3

A DOI:10.11958/j.issn.0253-9896.2015.06.026

國(guó)家“十二五”計(jì)劃重大傳染病防治專項(xiàng)結(jié)核病專項(xiàng)（2013ZX10003003-002-002）

1新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（郵編832000）；2新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原微生物與免疫學(xué)教研室

柴璐璐（1988），女，在讀碩士，主要從事中樞系統(tǒng)感染研究

△E-mail:wang832000@sina.com