清熱止咳口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥效學(xué)研究*

任　榮，陳　冠，李正翔

清熱止咳口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及藥效學(xué)研究*

任榮1，陳冠2，李正翔1

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052；2.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津300020）

［目的］建立清熱止咳口服液的定性、定量測(cè)定方法，并建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)清熱止咳口服液進(jìn)行藥效學(xué)觀察。［方法］采用薄層色譜法（TLC）對(duì)處方中瓜蔞皮、苦杏仁進(jìn)行薄層鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)處方中前胡中的白花前胡甲素、白花前胡乙素同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定。采用氨水引咳法觀察小鼠的咳嗽潛伏期和咳嗽次數(shù)。［結(jié)果］清熱止咳口服液中瓜蔞皮、苦杏仁薄層色譜鑒別特征明顯，專屬性強(qiáng)；白花前胡甲素、白花前胡乙素分別在10.2～102.00 mg/L，3.96～39.60 mg/L范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。白花前胡甲素、白花前胡乙素平均回收率分別為98.94% （RSD 1.39%）、99.74%（RSD 1.75%）。清熱止咳口服液可以明顯延長(zhǎng)濃氨水引起的咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)（P＜0.05）。［結(jié)論］該質(zhì)量控制方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可用于清熱止咳口服液質(zhì)量控制。清熱止咳口服液具有顯著的止咳作用。

清熱止咳口服液；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；前胡；藥效學(xué)

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2014.04.12

清熱止咳口服液為天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院在多年臨床經(jīng)驗(yàn)方的基礎(chǔ)上研制的中藥制劑。由前胡、瓜蔞皮、苦杏仁、桑白皮、地骨皮、桑葉、蘆根、竹茹、枇杷葉等9味中藥組成，具有清熱宣肺，止咳平喘的作用，用于治療風(fēng)熱感冒，咳嗽氣喘。其中前胡為方中君藥，臨床應(yīng)用十分廣泛，具有散風(fēng)清熱，降氣化痰的作用［1-7］。藥理研究表明，白花前胡具有鈣通道阻滯、降壓、抗腫瘤、抗病毒、抗炎及逆轉(zhuǎn)腫瘤、多藥耐藥等多種生物活性［8-10］，用于風(fēng)熱咳嗽痰多，痰熱喘滿，咯痰黃稠等癥。在研制過(guò)程中，筆者建立了其含量測(cè)定法，利用高效液相色譜法（HPLC）對(duì)前胡中的白花前胡甲素、白花前胡乙素同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定。瓜蔞皮、苦杏仁為方中臣藥，瓜蔞皮具有清熱滌痰，寬胸散結(jié)，潤(rùn)燥滑腸之功效，國(guó)內(nèi)外對(duì)其藥理活性和鑒別研究較多［11-13］?？嘈尤蕿橹袊?guó)傳統(tǒng)中藥，具有止咳平喘、潤(rùn)腸通便的功效，近年來(lái)對(duì)其研究較多［14-15］。對(duì)瓜蔞皮、苦杏仁進(jìn)行薄層（TLC）鑒別，并對(duì)該方法學(xué)進(jìn)行考察，結(jié)果表明該方法可以用于該復(fù)方制劑的質(zhì)量控制。本研究在總結(jié)制劑臨床經(jīng)驗(yàn)的前提下，運(yùn)用咳嗽動(dòng)物模型，初步考察制劑對(duì)咳嗽的治療機(jī)制，為藥物的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器日本島津LC-10ATVP型高效液相色譜儀；島津SPD-10AVP紫外檢測(cè)器；AS3120超聲波清洗儀。

1.2試藥清熱止咳口服液（規(guī)格：每瓶100 mL，批號(hào)：20120712、20121722、20120728）：白花前胡甲素對(duì)照品（批號(hào)：111711-200602）；白花前胡乙素對(duì)照品（批號(hào)：111904-201203）；苦杏仁苷對(duì)照品（批號(hào)：110820-201004）；瓜蔞皮對(duì)照藥材（批號(hào)：121184-201003，）；以上對(duì)照品和對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；磷酸可待因（國(guó)藥集團(tuán)工業(yè)有限公司，批號(hào)：20111120）甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.3動(dòng)物昆明小鼠60只（SPF級(jí)），雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）-2009-0017。

2　薄層鑒別

2.1瓜蔞皮的薄層鑒別

2.1.1供試品溶液制備取本品40 mL，用水飽和的正丁醇提取2次（40 mL，40 mL），合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蒙倭考状既芙?，作為供試品溶液?/p>

2.1.2對(duì)照藥材溶液的制備取瓜蔞皮對(duì)照藥材2g，研碎，過(guò)4號(hào)篩，用水飽和的正丁醇50 mL，超聲處理（功率為250 W，頻率為33 kHz）30 min，濾過(guò)，蒸干濾液，用少量甲醇溶解，作為對(duì)照藥材溶液。

2.1.3陰性樣品溶液制備按處方比例制成不含瓜蔞皮的陰性樣品，同供試品溶液制備方法處理，作為陰性樣品溶液。

2.1.4薄層鑒別方法取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（4∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，置105℃加熱數(shù)分鐘檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品色譜中不顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.2苦杏仁的薄層鑒別

2.2.1供試品溶液的制備取本品20 mL，用乙醚20 mL進(jìn)行萃取，棄去乙醚層，水層加乙醇100 mL搖勻，濾過(guò)，蒸干濾液，用少量甲醇溶解，作為供試品溶液。

2.2.2對(duì)照藥材溶液的制備取苦杏仁對(duì)照藥材2g，置索式提取器中，加二氯甲烷適量，加熱回流2 h，棄去二氯甲烷液，藥渣揮干，加甲醇30 mL，加熱回流30 min，冷卻，濾過(guò)，濾液作為對(duì)照藥材溶液。

2.2.3對(duì)照品溶液的制備取苦杏仁苷對(duì)照品，用甲醇溶解配置成1 mL含2 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.4陰性樣品溶液的制備按處方比例制成不含苦杏仁的陰性樣品，同供試品溶液制備方法處理，作為陰性樣品溶液。

2.2.5薄層鑒別方法吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶26∶10）5～10℃放置12 h的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以磷鉬酸硫酸溶（磷鉬酸2 g，加水20 mL使溶解，再緩緩加入硫酸30 mL，混勻），置105℃加熱數(shù)分鐘檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。陰性樣品色譜中不顯相同顏色的斑點(diǎn)。

3　含量測(cè)定

3.1色譜條件色譜柱：島津ULTRON VX-ODS （250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇-水（V∶V=7∶3）；檢測(cè)波長(zhǎng)：321 nm；流速：1.0 mL/min。柱溫：室溫；20 μL定量環(huán)進(jìn)樣。理論塔板數(shù)以白花前胡甲素計(jì)算不小于5 000，以白花前胡乙素計(jì)算不小于4 500。

圖1　瓜蔞皮TLC圖譜Fig.1　TLC of Pericarpium Trichosanthis

圖2　苦杏仁TLC圖譜Fig.2　TLC of Armeniacae Semen Amarum

3.2對(duì)照品溶液的制備精密稱取白花前胡甲素對(duì)照品、白花前胡乙素對(duì)照品適量，分別加甲醇制成0.102 g/L和0.039 6 g/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

3.3供試品溶液的制備精密量取清熱止咳口服液10 mL，用乙醚提取2次（20 mL，20 mL），合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)眉状既芙?，移?0 mL量瓶中，用甲醇少量洗滌容器，洗液并入量瓶中，用甲醇定容，即得供試品溶液。

3.4陰性對(duì)照液的制備取按處方比例并以相同工藝制備的缺前胡的清熱止咳口服液，按“3.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

3.5系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)分別取“3.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇制成1mL含白花前胡甲素50.1μg，白花前胡乙素19.8 μg的混合溶液。供試品溶液以及陰性對(duì)照液，按上述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察系統(tǒng)適用性。HPLC色譜圖見(jiàn)圖3。白花前胡甲素保留時(shí)間約為15 min，陰性對(duì)照液無(wú)干擾。

3.6線性范圍考察取3.2項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇制成含白花前胡甲素10.2、20.4、50.1、71.4、102 mg/L，白花前胡乙素3.96、7.92、19.8、27.7、39.6 mg/L的系列混合對(duì)照品溶液，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定色譜峰面積，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程：白花前胡甲素：Y?=52 985X+9 848.1（r=0.999 9）；白花前胡乙素：Y?=51 777X+24 258（r=0.999 9）；結(jié)果表明：白花前胡甲素、白花前胡乙素分別在10.2～102mg/L，3.96～39.6 mg/L范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。

圖3　HPLC色譜圖Fig.3　HPLC chromatograms

3.7精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取“3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定兩種對(duì)照品峰面積，得出白花前胡甲素日內(nèi)精密對(duì)RSD為0.96%，白花前胡乙素日內(nèi)精密對(duì)RSD為0.92%。結(jié)果表明本法精密度良好。

3.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取“3.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、10、24 h后，注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰面積，白花前胡甲素RSD為1.36%（n=6），白花前胡乙素RSD為1.15%（n=6），結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.9重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批樣品，按“3.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別測(cè)定色譜峰面積，白花前胡甲素RSD為0.98%（n=6）。白花前胡乙素RSD為0.79%（n=6），結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

3.10回收率實(shí)驗(yàn)精密秤取6份已知準(zhǔn)確含量的樣品（20120712）各5 mL，每份分別精密加入適量的白花前胡甲素、白花前胡乙素對(duì)照品，按供試品溶液制備及測(cè)定方法操作，進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

3.11樣品測(cè)定取“3.3”項(xiàng)下供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

暫定本品按白花前胡甲素計(jì)1 mL不得少于0.1mg，按白花前胡乙素計(jì)1mL不得少于0.02mg。

4　藥效學(xué)研究

［16］方法，采用氨水引咳法。取昆明種小鼠（20±2）g，60只，雌雄各半，隨機(jī)分為5組：清熱止咳口服液高劑量組0.86 mL/kg、中劑量組0.43 mL/kg、低劑量組0.22 mL/kg分別給予；陽(yáng)性對(duì)照組給予磷酸可待因0.03 g/kg；空白對(duì)照組給予0.9%生理鹽水20 mL/kg。各組小鼠每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥5 d，末次給藥后30 min，將小鼠置于500 mL廣口瓶中，放入一個(gè)含0.5 mL氨水棉球，觀察和記錄小鼠的咳嗽潛伏期和3 min咳嗽次數(shù)。以單因素方差分析比較組間差異，結(jié)果見(jiàn)表3。

表1　加樣回收率實(shí)驗(yàn)Tab.1　Results of recovery tests

表2　樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab.2　Results of content determination

由表3可見(jiàn)，清熱止咳口服液高劑量組對(duì)小鼠咳嗽潛伏期有極顯著的延長(zhǎng)作用（P＜0.01），中劑量組有顯著的延長(zhǎng)作用（P＜0.05）；高、中劑量組3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。說(shuō)明清熱止咳口服液對(duì)小鼠的止咳作用良好。

5　討論

參考《中國(guó)藥典》（2010版）前胡的高效液相色譜檢測(cè)法，曾試過(guò)不同比例的甲醇-水為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)以甲醇-水（7∶3）為流動(dòng)相，色譜峰的分離度較好，峰型較好，故采用之。

表3　清熱止咳口服液對(duì)小鼠濃氨水引咳的影響Tab.3　The anti-cough effect of Qingre Zhike oral liquid induced by ammonia water

表3　清熱止咳口服液對(duì)小鼠濃氨水引咳的影響Tab.3　The anti-cough effect of Qingre Zhike oral liquid induced by ammonia water

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別　n　潛伏期（s）　咳嗽次數(shù)（次）空白組　1 2 　1 5 ± 5 　3 0 ± 1 1低劑量組　1 2 　2 2 ± 1 3 　2 8 ± 1 1中劑量組　1 2 　2 5 ± 1 2* 　2 1 ± 5*高劑量組　1 2 　3 0 ± 1 5 ** 　2 2 ± 7*磷酸可待因組　1 2 　3 5 ± 1 6 ** 　1 6 ± 4 * *

在進(jìn)行苦杏仁薄層鑒別以及前胡含量測(cè)定的前處理的過(guò)程中，首先按《中國(guó)藥典》（2010版）［17］中苦杏仁和前胡的前處理采取二氯甲烷和氯仿進(jìn)行提取，但經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述兩種溶劑萃取均產(chǎn)生嚴(yán)重的乳化現(xiàn)象，不利于實(shí)驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行，改用乙醚萃取后，可以避免乳化，樣品提取完全，利于實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，故最終采用乙醚作為樣品的提取溶劑。

白花前胡甲素（±praerup torin A）和丙素（± praerup torin A）、白花前胡乙素（±praerup torin B）和丁素（+praerup to rin B）是2對(duì)旋光異構(gòu)體［18］，應(yīng)用反相高效液相色譜柱不能將它們分開(kāi)。因此，測(cè)定的白花前胡甲素含量，實(shí)際上是白花前胡甲素和丙素混合成分，同樣，測(cè)定白花前胡乙素含量也含有丁素。在藥典的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)2種香豆素成分同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定，為制定清熱止咳口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

咳嗽是臨床常見(jiàn)癥狀，多種疾?。ㄉ虾粑栏腥?、肺炎、急慢性氣管炎）多可出現(xiàn)［19］?？人允侨梭w重要的防御機(jī)能，可清除呼吸道內(nèi)異物和分泌物。但持續(xù)嚴(yán)重的咳嗽使患者感到不適，嚴(yán)重情況可影響休息和睡眠，甚者可造成呼吸道的損傷，并引起多種并發(fā)癥。故必要時(shí)需用止咳、鎮(zhèn)咳藥加以緩解。中藥止咳具有悠久的歷史，本制劑對(duì)咳嗽治療具有顯著的作用。本研究對(duì)主要藥效學(xué)指標(biāo)咳嗽次數(shù)、咳嗽潛伏期進(jìn)行了初步探討、研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本制劑能明顯減少小鼠咳嗽次數(shù)、延長(zhǎng)氨水引起的咳嗽潛伏期。值得注意到的是，高劑量組的清熱止咳口服液可以極顯著的延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期?？沙醪阶C明本制劑的止咳作用，為其臨床應(yīng)用提供了藥效學(xué)依據(jù)。

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（本文編輯：高杉，馬英）

Research on quality standards and pharmacological effects of Qingre Zhike oral liquid

REN Rong1，CHEN Guan2，LI Zheng-xiang1
（1.General Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300052，China；2.Tianjin Institute of Medical Sciences，Tianjin 300020，China）

［Objective］To establish quality standard and evaluate the pharmacodynamic effects of Qingre Zhike oral liquid.［Methods］TLC method was used to identify Pericarpium Trichosanthis and Prunus Armeniaca in Qingre Zhike oral liquid.The contents of Praeruptorin A and Praeruptorin B were determined by HPLC.The cough settling effect was observed on the ammonia water induced cough model of mouse.［Results］Established TLC had clear spots without interference of the negative control sample.Linear ranges of Praeruptorin A and Praeruptorin B were 10.20～102.00 μg/mL and 3.96～39.60 μg/mL，average recoveries were 98.94%（RSD 1.39%）and 99.74%（RSD 1.75%），respectively.High dose and middle dose group of Qingre Zhike oral liquid could produce a protective effect on the cough induced by ammonia（P＜0.05）.［Conclusion］The method is simple，rapid，reproducible and specific，and it can be used for the quality control of Qingre Zhike oral liquid.Qingre Zhike oral liquid has the anti-cough effect.

Qingre Zhike oral liquid；quality standard；radix peucedani；pharmacological effect

R282.73

A

1672-1519（2015）04-0239-05

天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目（2012KY30）。

任榮（1979-），男，碩士，主管藥師，研究方向?yàn)樗幬镏苿?/p>

李正翔，E-mail：lee41@sina.com。

（2014-12-18）