黃芩苷體外抗流感病毒作用的研究*

劉曉婷，張　沂，顧立剛，吳　珺，邱澤計，王玥琦

·中藥研究·

黃芩苷體外抗流感病毒作用的研究*

劉曉婷1，張沂1，顧立剛1，吳珺1，邱澤計1，王玥琦2

（1.北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院中醫(yī)藥防治病毒性疾病實驗室，北京100029；2.北京中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學關鍵技術中心，北京100029）

［目的］通過觀察黃芩苷對甲型流感病毒（H1N1）感染人肺癌細胞株（A549細胞株）的作用，探討其在體外抗甲型流感病毒的作用。［方法］通過細胞病變效應（CPE）觀察黃芩苷對病毒致細胞病變作用的影響，采用四甲基偶氮唑藍（MTT）比色法檢測藥物對人肺癌細胞株A549的最大無毒濃度（TC0）和半數(shù)中毒濃度（TC50）。檢測藥物不同給藥方式和作用時間的吸光度，比較各組抗病毒有效率，找出黃芩苷最佳抗病毒作用方式。采用Probit回歸計算最佳作用方式時其對病毒感染的半數(shù)抑制濃度（IC50）以及治療指數(shù)（TI）。［結果］在7.920～0.495 mg/L范圍內(nèi)的黃芩苷作用24～48 h，對流感病毒所致的細胞病變作用有明顯的抑制作用，細胞存活率明顯高于病毒感染組。其中，抗病毒生物合成組（Ⅲ）在給藥后48 h，其抗病毒有效率最高，濃度為3.960 mg/L組的細胞存活率最高，抗病毒有效率達89.107%。計算該條件下黃芩苷IC50為1.399 mg/L，TI為22.608。［結論］黃芩苷在一定濃度下有抗病毒作用，主要是通過抑制病毒在感染的A459細胞內(nèi)生物合成而發(fā)揮抗病毒作用。

黃芩苷；抗流感病毒；體外；A549；H1N1

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2014.04.10

流感病毒引起的感冒是世界性呼吸道傳染疾病，每年季節(jié)性流感感染5%～20%的人口，造成約25～50萬人死亡［1］，對人類生命安全造成了極大的威脅［2］。目前抗流感病毒藥物主要是M2離子通道抑制劑（金剛烷胺和金剛乙胺）和病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑（奧司他韋和扎那米韋）［3-4］，但都由于藥物毒副作用和耐藥性，在臨床應用受限明顯［5］。

黃芩苷為黃酮類化合物，是黃芩有效成分之一，有多種藥理活性。體內(nèi)實驗研究表明：黃芩苷通過降低炎性細胞因子的分泌水平，減緩流感病毒誘導小鼠肺部炎性病理損傷［6］；還能通過影響細胞凋亡受體途徑FAS/FASL，病毒感染小鼠肺組織細胞的凋亡系統(tǒng)［7］，發(fā)揮抗流感病毒感染作用。本實驗主要研究黃芩苷抗流感病毒H1N1感染A549作用，為進一步探討其抗流感病毒作用機制研究奠定基礎。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1病毒與細胞甲型H1N1流感病毒，A1/黔防/166/85株，使用時接種于9日齡雞胚尿囊腔，37℃培養(yǎng)2 d，連續(xù)傳代2次后，收集尿囊液，測血凝滴度為2-7。人肺癌細胞株（A549）購自中國協(xié)和醫(yī)科大學基礎醫(yī)學細胞中心，培養(yǎng)基McCoy’s 5A中含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素。

1.1.2藥物與試劑黃芩苷，黃色粉末，純度98.2%，分子量446.35。陽性對照磷酸奧司他韋膠囊（達菲），瑞士巴塞爾豪夫·邁羅氏公司生產(chǎn)產(chǎn)品批B1354，分裝批號SH0037。McCoy’s5A培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco公司，美國）；0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸（EDTA，Thermo公司，美國）；四甲基偶氮唑藍（MTT）和二甲亞砜（DMSO）（Sigma公司，美國）。三聯(lián)溶解液：SDS 10 g，異丁醇5 mL，10 mol/L氯化氫（HCl）0.1 mL。細胞培養(yǎng)液（含10%胎牛血清和1% 青-鏈霉素混合物的完全McCoy’s 5A培養(yǎng)基），細胞維持液（含2.0%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基）；1.5%雞紅細胞混懸液。

1.1.3實驗儀器超凈工作臺（北京碧都凈化設備有限公司）、酶標儀（北京普朗新技術有限公司DNM-9602）、細胞培養(yǎng)箱（BINDER WMK-02型）、光學顯微鏡（Olympus Co）和倒置光顯微鏡（Olympus Co）、水浴箱（北京市醫(yī)療設備廠小型三用水箱）、離心機（Heraeus Labofuge 400R）、Astell全自動高壓滅菌器（北京東迅天地醫(yī)療儀器有限公司）、低溫冰箱（Thermo model 702）。

1.2實驗方法

1.2.1細胞常規(guī)培養(yǎng)復蘇細胞A549加細胞培養(yǎng)液經(jīng)3～4次傳代后，細胞恢復正常生長周期。將生長狀態(tài)良好的細胞加入0.25%胰酶-0.02%EDTA消化細胞，洗脫后加入細胞培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為每毫升1.5×105個。吹打均勻，吸取細胞懸液加至96孔板中，每孔100 μL，在37℃，5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6～8 h，使得細胞呈單層貼于孔底。

1.2.2病毒感染性測定用無血清McCoy’s 5A培養(yǎng)基作為稀釋液對流感病毒H1N1進行連續(xù)10倍遞次稀釋，將各稀釋度的病毒液接種于A549細胞單層吸附的96孔板中，每孔100 μL，每個稀釋度平行6個復孔，同時設正常細胞對照，正常細胞對照孔不加病毒，只加稀釋液。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，小心吸棄各孔病毒液換用細胞維持液，繼續(xù)置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后在倒置顯微鏡下觀察細胞病變效應（CPE），記錄病變程度和孔數(shù)，以細胞對照無明顯退變，病毒感染細胞病變率達50%及以上的細胞孔為病變孔，細胞病變率小于50%的為非病變孔，按Reed-Muench法計算病毒的半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量（TCID50）。

1.2.3藥物細胞毒性實驗取A549細胞單層吸附的96孔板輕輕吸棄上清液，加入用細胞維持液倍比稀釋的黃芩苷藥液，每孔100 μL。藥物每個稀釋度平行6個復孔，同時設正常細胞對照。置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，觀察黃芩苷對A549細胞的CPE，根據(jù)Reed-Muench法計算藥物最大無毒濃度（TC0）。加入MTT（終濃度0.5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再每孔加入100 μL SDS，輕輕混勻后再培養(yǎng)12 h，A1孔調(diào)零，用酶標儀在570 nm波長處測定細胞各實驗組的吸光度值（A），計算細胞存活率。公式為：細胞存活率%=實驗組吸光度值（A）/細胞對照組吸光度值（A）×100%。采用SPSS 20.0軟件Probit回歸計算藥物半數(shù)中毒濃度（TC50）。

1.2.4藥物抗病毒方式檢測取已長成單層細胞的培養(yǎng)板，吸棄細胞培養(yǎng)液，加磷酸鹽緩沖溶液（PBS）輕洗細胞面2次，根據(jù)病毒復制周期，設計3個藥物抗病毒作用靶點［8］：藥物預防組（Ⅰ）是先加入藥24 h，再加終濃度100TCID50病毒作用2 h；抗病毒吸附組（Ⅱ）是病毒與藥同時加入；抗病毒生物合成組（Ⅲ）是先加入終濃度100TCID50病毒作用2 h后再加入黃芩苷。分別加入最大無毒濃度以下對倍稀釋的5個濃度黃芩苷藥液，設磷酸奧司他韋為陽性對照組，同時設正常細胞對照組和病毒對照組，每濃度4個復孔，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。再加入MTT（終濃度0.5 g/L）和SDS，用酶標儀測定吸光度A值。計算藥物抑制病毒有效率，公式為抑制率%=（藥物處理組平均A值-病毒對照組平均A值）/（細胞對照組平均A值-病毒對照組平均A值）×100%。

1.2.5藥物抗病毒作用時間檢測取已長成單層細胞的培養(yǎng)板，吸棄細胞培養(yǎng)液，加PBS液輕洗細胞面2次，接種100TCID50的病毒液，每孔100 μL，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h。然后吸棄病毒液，加入TC0以下5個對倍稀釋的黃芩苷藥液，設磷酸奧司他韋為陽性對照組，同時設有正常細胞對照組和病毒對照組，每濃度6個復孔。置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)24、36、48、60、72 h。在相應時間分別取出培養(yǎng)板，加MTT（終濃度0.5 g/L），用酶標儀在570 nm波長下測定吸光度A值（A570），計算藥物抑制病毒有效率。

1.2.6藥物最佳抗病毒方案驗證取已長成單層細胞的培養(yǎng)板，吸棄細胞培養(yǎng)液，加PBS液輕洗細胞面2次，按照“藥物抗病毒方式檢測”和“藥物抗病毒作用時間檢測”項下結果操作，設磷酸奧司他韋為陽性對照組，同時設正常細胞對照組和病毒對照組。再加入MTT（終濃度0.5 g/L）和SDS，用酶標儀測定A值。計算藥物抑制病毒有效率，并用SPSS 20.0軟件的Probit回歸計算藥物對病毒所致細胞的CPE的半數(shù)抑制濃度（IC50）和治療指數(shù)（TI），TI= TC50/IC50。

1.2.7藥物對流感病毒血凝素的影響取培養(yǎng)48 h后各組實驗細胞，將其反復凍融3次，吹打細胞板底部使細胞脫落，靜置5～10 min后，吸上清。取24孔血凝板每孔加生理鹽水200 μL，分別加入各組細胞上清液200 μL，進行一系列濃度稀釋，第1孔設為陰性對照（只加生理鹽水和雞血）。每孔加入1.5%雞血200 μL，輕輕混勻置于37℃溫箱，2 h后觀察并記錄實驗結果。

1.3統(tǒng)計方法各項實驗均重復3次以上，然后分別計算各數(shù)據(jù)平均值及標準差。數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計分析。多組間差異采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法進行。結果以均值±標準差（x±s）表示，P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2　結果

2.1病毒TCID50的測定觀察病毒所致A549細胞病變情況，按Reed-Muench法計算流感病毒H1N1的TCID50=10-3.778/0.1 mL。

2.2藥物抗流感病毒實驗

2.2.1藥物細胞毒性實驗黃芩苷對A549細胞毒性作用表現(xiàn)為，細胞折光性增加、細胞變圓、破碎、脫落，且藥物對細胞的毒性作用在一定范圍內(nèi)隨著藥物濃度的降低，細胞存活率增加。當濃度降低至7.920 mg/L時CPE輕微不明顯，細胞形態(tài)、數(shù)量、折光率與正常細胞對照組差異無統(tǒng)計學意義，因此黃芩苷的TC0為7.920 mg/L。加入MTT測定A值后經(jīng)SPSS軟件Probit回歸計算檢測藥物的半數(shù)毒性濃度TC50為31.624 mg/L。

2.2.2藥物抗病毒方式實驗以3種方式給予黃芩苷后，將各組細胞培養(yǎng)至48 h后加入MTT測定A值計算抑制病毒有效率。其中藥物預防組（Ⅰ）黃芩苷各濃度的抑制病毒有效率較低，小于50%；抗病毒吸附組（Ⅱ）各濃度的抑制病毒有效率稍高于藥物預防組，在40%～70%之間；抗病毒生物合成組（Ⅲ）各濃度的抑制病毒有效率較高，均達50%以上，最高抑制有效率可達89.107%（3.960 μg/mL）。見表1。

表1　黃芩苷不同給藥方式抗病毒有效率結果Tab.1　Inhibitory rate of the baicalin on influenza virus A（H1N1）in different manners

2.2.3藥物抗病毒有效率檢測感染病毒后細胞A549加黃芩苷培養(yǎng)24、36、48、60、72 h，進行MTT測定A值計算抑制病毒有效率。結果表明黃芩苷在24～72 h內(nèi)，有明顯抗病毒作用，48 h抗病毒作用較高，此后60～72 h，抗病毒作用無明顯變化。陽性藥奧司他韋在36 h時達到較好的抗病毒有效率，并且與48h之后的抗病毒有效率無統(tǒng)計學差異。見表2。

表2　黃芩苷不同作用時間抗病毒有效率結果Tab.2　Inhibitory rate of the baicalin on influenza virus A（H1N1）in different time

根據(jù)黃芩苷抗病毒作用方式和時間的實驗結果，得出黃芩苷抗病毒最佳方案為，即接種100TCID50的病毒液，每孔100 μL，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h，然后加入最大無毒濃度以下對倍稀釋的5個濃度黃芩苷藥液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加入MTT測定A值，計算此方案下黃芩苷IC50為1.399 mg/L，TI為22.608。當黃芩苷濃度為3.960和0.990 mg/L時，抑制病毒率較高，分別為87.403%和77.069%。

2.2.4藥物對流感病毒血凝素的影響收集實驗各組細胞上清液，進行凝集實驗，結果進行對數(shù)轉化，病毒對照組血凝滴度為1.903，黃芩苷濃度由高到低血凝滴度分別為1.505，1.204，1.447，1.301，1.602，結果可見黃芩苷組比病毒對照組滴定終點均明顯提前，且黃芩苷濃度在3.960和0.990 mg/L濃度時，與模型組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），與陽性藥組比較無統(tǒng)計學差異，見表3。

表3　黃芩苷對流感病毒血凝素的影響Tab.3　Inhibitory effect of baicalin to the hemagglutination titer of the influenza virus in vitro

3　討論

人禽流行性感冒是由禽甲型流感病毒中某些亞型毒株突破種屬屏障而感染人，臨床表現(xiàn)以發(fā)熱、肌痛、咽痛、咳嗽等呼吸道癥狀和惡心、腹痛、腹瀉等消化道癥狀為主，少數(shù)患者可出現(xiàn)急性呼吸窘迫征、多臟器衰竭，病死率較高。任何年齡段均可患病，無性別差異，以12歲以下兒童發(fā)病率較高目前［9］。

藥物抗流感病毒主要有3種：干擾素，M2離子通道抑制劑和病毒神經(jīng)氨酸酶抑制劑。干擾素主要抑制病毒復制；金剛烷胺作用于流感病毒膜蛋白和血凝素蛋白，阻止病毒進入宿主細胞；奧司他韋抑制神經(jīng)氨酸酶活性，阻止成熟的病毒離開宿主細胞?；帉α鞲胁《居幸欢ǖ目共《咀饔茫遣《竞芸爝m應來自藥物的作用，并且出現(xiàn)逃避和耐藥［10］，或出現(xiàn)嚴重的不良反應如腹瀉、精神狂亂（尤其對兒童）、幻覺甚至自殺身亡，臨床應用受限。在中國，很早就開始研究中藥制劑抗流感的作用［11］，近年來也開始著手于對中藥有效部位抗流感病毒作用的研究［12］。

黃芩苷是一種來源于植物的多羥基黃酮類化合物，具有抗病毒［13］，抗氧化［14］，抗腫瘤［15］，促進神經(jīng)干細胞分化［16］等作用。已有研究表明，黃芩苷可以對流感病毒感染導致的小鼠死亡有很好的保護作用，對小鼠肺內(nèi)的流感病毒有一定的清除作用，能降低肺內(nèi)流感病毒的血凝滴度和感染力［17］，通過下調(diào)TLR7/MyD88信號通路，降低病毒感染所致小鼠肺組織病理損傷和炎癥反應［18］。

本實驗結果表明，黃芩苷在病毒感染后24～48 h有抗病毒作用，基本上可以抑制流感病毒在細胞造成的損傷，并且藥物作用48 h后，抗病毒作用不隨時間增長而有明顯變化。不同給藥方式給予黃芩苷，其抗病毒效率不同：藥物預防組（Ⅰ）其抗病毒效率低于50%，表明黃芩苷阻斷病毒侵入細胞的作用較差。抗病毒吸附組（Ⅱ）其抗病毒效率在40%～70%，表明黃芩苷有抑制病毒吸附于細胞，抗病毒生物合成組（Ⅲ）其抗病毒效率較高，在50%～90%，濃度為3.960和0.990 mg/L時，抑制病毒率較高，分別為87.403%和77.069%，說明黃芩苷對病毒所致的細胞病變有抑制作用，且為主要抗病毒的作用。以上結果說明，黃芩苷抗病毒作用是通過多種方式來實現(xiàn)的，能阻斷病毒吸附、穿入細胞，抑制病毒在宿主細胞內(nèi)的復制增殖，并且主要是抑制病毒吸附后的復制增殖起到抗病毒作用，這與已有文獻報道的黃芩苷可顯著降低Caspase 8/3活性，通過抑制Caspase 8，進一步抑制Caspase 3活性，調(diào)控細胞周期分布發(fā)揮抗病毒作用［19］相符合。

流感病毒包膜上含有血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）兩種蛋白。HA在病毒進入細胞過程中起到至關重要的作用。HA蛋白經(jīng)絲氨酸酶水解后分成HA1和HA2，HA1與宿主細胞膜唾液酸受體相結合，引導病毒進入細胞，HA2協(xié)助包膜與宿主細胞膜相互融合［20］。因此，在抗病毒藥篩選初期，常用血凝實驗作為輔助驗證實驗。本研究血凝實驗結果進一步驗證，病毒感染細胞后給予不同濃度的黃芩苷，細胞上清中HA比病毒對照組均有不同程度的下降，可能因黃芩苷降低病毒感染細胞的HA、NA和M基因mRNA表達［15］，并且黃芩苷濃度為3.960和0.990mg/L時，血凝結果與陽性藥組比較無統(tǒng)計學差異，說明其抗病毒效果顯著。

綜上所述，黃芩苷體外實驗中有一定的抗流感病毒作用，早期可以抑制流感病毒吸附、穿入細胞，主要作用是在后期抗病毒生物合成作用。但是具體在流感病毒生物合成周期的哪個環(huán)節(jié)起作用及其作用機制還不清楚，有必要在分子水平對黃芩苷做進一步抗病毒機制研究。

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（本文編輯：高杉，馬英）

Inhibitory effect of Baicalin on influenza virus A H1N1 in vitro

LIU Xiao-ting1，ZHANG Yi1，GU Li-gang1，WU Jun1，QIU Ze-ji1，WANG Yue-qi2
（1.Laboratory of Chinese Medicine on Viral Disease，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2.School of Pre-clinical Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

［Objective］To investigate the inhibitive effect of Baicalin on influenza A H1N1 virus infection in epithelial cell line A549. ［Methods］The morphologic study and cytopathogenic effect（CPE）of cells were observed through inverted microscope.The maximum non-toxic concentration（TC0）and the median toxic concentration（TC50）were detected were assayed by MTT method.Furthermore，to identify the best method of administration and action time of baicalin，A549 cell infected with H1N1 were detected by using MTT method. The median inhibitory concentration（IC50）and treatment indexes（TI）of the best method of baicalin on viral infection were calculated with Probit regression.［Results］Baicalin had a significant inhibitory effect on influenza A H1N1 virus infection in epithelial cell line A549. The survival rate of A549 was significantly higher which added baicalin from 7.920 to 0.495 μg/mL compared with the model without the drug.In addition，the best method of baicalin against viral infection were added 2 hours after cells infected and treated 48 hours.The best survival rate was 89.107%with 3.960 μg/mL of baicalin.In this administrated method，IC50was 1.399 μg/mL，and TI was 22.608.［Conclusion］Patients suffered from CAP with chest CT consolidation shadows can be benefited from the use of the safflower yellow injection and the safflower yellow injection can be helped for the absorption of chest CT-suggested consolidation shadows.

Baicalin；antiviral；in vitro；A549；H1N1

R692.3

A

1672-1519（2015）04-0229-05

國家自然科學基金資助項目（81173371）。

劉曉婷（1983-），女，在讀博士研究生，研究方向為中醫(yī)藥免疫調(diào)節(jié)的分子機制。

顧立剛，E-mail：lggulg@163.com。

（2014-11-20）