人臍帶血造血干細胞體外分化為NK細胞的效率及功能檢測

羅琦，尹潔，李楊，黃珊，王璽，何景華△

人臍帶血造血干細胞體外分化為NK細胞的效率及功能檢測

羅琦1，尹潔2，李楊2，黃珊2，王璽2，何景華1△

目的檢測人臍帶血造血干細胞（HSCs）體外分化為自然殺傷（NK）細胞的效率及功能。方法從人臍帶血中分離CD34+HSCs，接種于含20 μg/L FMS樣酪氨酸激酶3配體（Flt3L）、干細胞生長因子（SCF）、白細胞介素（IL）-7、IL-15及IL-21的SCGM培養(yǎng)基中，定向誘導CD34+HSCs分化為NK細胞。觀察細胞生長狀態(tài)，在分化的第7、14、21及28天，采用流式細胞術檢測各階段CD56、NKG2D、NKp46、CD3、CD19及CD34等細胞免疫表型的表達變化；分化的第21、28天，以分化得到細胞為效應細胞，K562細胞作為靶細胞，設置8∶1、4∶1、2∶1和1∶1 4組效靶細胞比，分別采用乳酸脫氫酶（LDH）細胞毒性檢測法和7AAD/CFSE標記法，檢測分化得到的細胞殺傷功能。結(jié)果臍帶血來源的CD34+HSCs在體外適宜的條件下可大量增殖；整個分化進程的不同階段中，CD3和CD19表達量差異無統(tǒng)計學意義，CD56、NKG2D及NKp46的表達量逐漸增加，最高達（72.57±1.60）%、（32.83±1.29）%和（29.53± 2.40）%，CD34的表達量逐漸降低，最低為（12.13±2.01）%。LDH毒性檢測法和7AAD/CFSE標記法測得最大殺傷效率可達（49.91±2.76）%和（40.87±1.12）%，8∶1、4∶1、2∶1和1∶1組NK細胞殺傷能力均依次降低（P＜0.05），誘導分化28 d的NK細胞殺傷能力與21 d差異無統(tǒng)計學意義。結(jié)論人臍帶血HSCs在體外適宜的培養(yǎng)條件下，可定向分化為NK細胞，誘導分化得到的NK細胞具有殺傷功能。

胎血；造血干細胞；殺傷細胞，天然；免疫表型分型；細胞毒性試驗，免疫；CD34+HSCs；體外分化；細胞殺傷

臍帶血（UCB）中富含造血干細胞（HSCs），是除骨髓和外周血之外的第3種HSCs的重要來源［1］。在適宜的條件下，HSCs可以在體內(nèi)和體外分化為自然殺傷（NK）細胞［2］。隨著細胞免疫治療的興起，NK細胞越來越為人們所重視。由于人體自身NK細胞數(shù)量有限，而且在NK細胞不同發(fā)育階段，甚至同一發(fā)育階段的不同組織中，NK細胞的表型和功能都存在很大的差異，這些都嚴重限制了NK細胞在臨床上大規(guī)模運用［3-4］。本研究利用從臍帶血中富集到的CD34+HSCs進行體外培養(yǎng)，加入相應細胞因子誘導其分化為NK細胞，并對誘導分化的NK細胞免疫表型及殺傷功能進行檢測，為研究不同發(fā)育階段的NK細胞的相應功能及其臨床應用提供實驗參考。

1　材料與方法

1.1材料新鮮人臍帶血取自天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院；人慢性骨髓性白血病細胞K562為天津市血液學研究所饋贈；羥乙基淀粉（HES）、人淋巴細胞分離液（Ficoll）均購自天津市灝洋生物制品科技有限責任公司；EDTA購自美國Amresco公司；Human CD34 Microbead Kit購自德國美天旎公司；細胞因子Human FMS樣酪氨酸激酶3配體（Flt-3L）、Human干細胞生長因子（SCF）、Human白細胞介素（IL）-7、Human IL-15 及Human IL-21均購自于美國Pepro Tech公司；Cell Gro?GMP SCGM培養(yǎng)基購自德國Cell Genix公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液（PS）及HEPES溶液均購自美國Hyclone公司；胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（MEM NEAA）、丙酮酸鈉（Sodium pyrovate）、β-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol）及慶大霉素（Gentamicin）均購自美國Gibco公司；乳酸脫氫酶（LDH）Cytotoxicity Assay Kit購自美國Promega公司；7-AAD/CFSE Cell-Mediated CytotoxicityAssay Kit購自美國Abcam公司；熒光標記抗體FITC-CD56、FITCNKp46、PE-NKG2D、Percp-Cy5.5-CD3、Percp-Cy5.5-CD19、APC-CD34均購自美國BioLegend公司；PBS緩沖液（pH 7.4，137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4）；CO2恒溫培養(yǎng)箱、Multiskan GO酶標儀（美國Thermo公司）；Accuri C6流式細胞儀（美國BD公司）。

1.2方法

1.2.1K562細胞培養(yǎng)將人慢性骨髓性白血病細胞K562置于RPMI-1640培養(yǎng)基中（含有10%FBS及1%PS溶液），置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d進行換液。

1.2.2CD34+HSCs分離將新鮮人臍帶血80 mL置于無菌血漿瓶中，按臍帶血∶HES=5∶1的比例加入HES，充分混勻，室溫靜置40 min以沉降紅細胞；離心管中預置15 mL Ficoll，緩慢加入2倍體積沉降紅細胞后的臍帶血，20℃，2 000 r/ min，離心20 min（升5降3）；移液管輕輕吸取單個核細胞層，置于PBS緩沖液（含2 mmol/L EDTA）中，洗滌細胞2次；計數(shù)后，按Miltenyi Human CD34 Microbead Kit說明書，從單個核細胞中富集CD34+HSCs。

1.2.3體外定向誘導CD34+HSCs分化為NK細胞從臍帶血中富集到CD34+HSCs共計4.0×105，接種于含SCGM（含有20%FBS、1%MEM NEAA、1 mmol/L Sodium Pyrovate、10 mmol/ L HEPES，1%Mercaptoethanol、25 mg/L Gentamicin及1%PS）培養(yǎng)基的24孔板中，同時加入濃度均為20 μg/L的Flt3L、SCF、IL-7、IL-15及IL-21等細胞因子，定向誘導CD34+HSCs進行體外分化，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)的1～7 d，每隔3 d對細胞進行半換液；7 d后，將所有細胞接種于6孔板中，每隔3 d對細胞進行換液。

1.2.4誘導分化細胞形態(tài)學和細胞生長曲線誘導分化的第7、14、21及28天，分別于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)；同時進行計數(shù)，計算均值，繪制生長曲線。

1.2.5誘導分化細胞免疫表型檢測誘導分化的第7、14、21 及28天，分別對細胞進行免疫表型檢測。細胞吹勻計數(shù)后，取1.0×106個細胞于含有500 μL DMEM培養(yǎng)基的流式管中，加入適量Fc受體阻斷劑，混勻后，4℃避光，封閉30 min；后加入適量待檢測的熒光標記的細胞表面分子特異性抗體，或熒光標記的同型對照抗體，4℃避光，染色30 min；加入1 mL DMEM培養(yǎng)基洗滌細胞1遍，再加入500 μL DMEM培養(yǎng)基重懸；用BD Accuri C6流式細胞儀進行檢測，CFlow Plus軟件獲取數(shù)據(jù)并進行分析，表達率≥20%為陽性。

1.2.6LDH細胞毒性檢測法檢測誘導分化細胞的殺傷功能誘導分化的第21天和第28天，對得到的NK細胞進行殺傷功能檢測。以K562作為靶細胞，濃度調(diào)整為2.0×105/ mL，按50 μL/孔接種于96孔板；以NK細胞作為效應細胞，濃度調(diào)整為3.2×106/mL，取1.6×105/50 μL細胞懸液進行倍比稀釋，每組效應細胞數(shù)目為0.8×105/50 μL、0.4×105/50 μL、0.2×105/50 μL和0.1×105/50 μL，按50 μL/孔接種于96孔板，最終效應細胞與靶細胞的比例分別為8∶1、4∶1、2∶1和1∶1。將該96孔板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h；250×g，離心4 min，取50 μL上清液按Promega LDH Cytotoxicity Assay Kit說明書進行LDH測定。

1.2.7熒光染料（7AAD/CFSE）標記法檢測誘導分化細胞殺傷功能在體外分化的第21天和第28天，對得到的NK細胞進行殺傷功能檢測。以K562作為靶細胞，濃度調(diào)整為2.0×106/ mL，按50 μL/孔接種于96孔板，用綠色熒光染料CFSE對靶細胞進行標記，4℃避光，染色30 min；加入NK細胞作為效應細胞，每組效應細胞數(shù)目為0.8×106/50 μL、0.4×106/50 μL、0.2× 106/50 μL和0.1×106/50 μL，最終效應細胞與靶細胞的比例分別為8∶1、4∶1、2∶1和1∶1，將該96孔板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h；用紅色熒光染料7AAD標記已死的效應細胞和靶細胞，4℃避光，染色30 min；用BD Accuri C6流式細胞儀進行檢測，CFlow Plus軟件獲取分析數(shù)據(jù)并進行分析。

1.3統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用±s表示，2組間均數(shù)比較用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1誘導分化NK細胞形態(tài)學及生長特點分化第1周，細胞呈懸浮狀均勻分布于培養(yǎng)基中，胞漿豐富，核仁明顯；分化第2、3周，細胞迅速增殖，部分細胞呈抱團狀；分化第4周，細胞生長緩慢，細胞體積增大，細胞內(nèi)顆粒增加，有少部分細胞開始呈現(xiàn)貼壁狀，見圖1。整個體外分化進程中，起始細胞數(shù)為4.0×105，分化第1周，細胞數(shù)增加到7.68×105；分化第2周，細胞開始大量增殖，細胞數(shù)明顯增多達4.48×106；分化第3周，細胞保持良好的增殖能力，細胞數(shù)達8.4×106；分化第4周，細胞生長緩慢，細胞數(shù)目維持在穩(wěn)定狀態(tài)，最終細胞數(shù)為8.96×106，整個進程中細胞倍增時間約為24 h，見圖2、3。

Fig.2　The growth curve of induced differentiation of NK cells圖2 誘導分化的NK細胞生長曲線

Fig.3　The amplification of induced differentiation of NK cells圖3　誘導分化的NK細胞擴增倍數(shù)

2.2誘導分化NK細胞免疫表型誘導分化的前2周，大部分細胞還處于干細胞狀態(tài)，CD34表達量相對較高，部分細胞開始表達CD56，而NKG2D和NKp46表達量較低；誘導分化的后2周，CD34表達量逐漸降低，絕大部分細胞表達CD56，NKG2D和NKp46的表達量也隨之增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；整個分化進程中，CD3和CD19表達量無明顯變化（P＞0.05），見表1。

Tab.1　Comparison of immune phenotypes of NK cells between different differentiation stages表1　誘導分化不同階段的NK細胞免疫表型比較（n=8，%，±s）

Tab.1　Comparison of immune phenotypes of NK cells between different differentiation stages表1　誘導分化不同階段的NK細胞免疫表型比較（n=8，%，±s）

＊P＜0.05；a與（1）比較，b與（2）比較，c與（3）比較，P＜0.05；表2、3同

誘導分化時間7 d（1）14 d（2）21 d（3）28 d（4）F誘導分化時間7 d（1）14 d（2）21 d（3）28 d（4）F CD56 23.90±1.81 37.37±1.86a63.13±2.64ab72.57±1.60abc3.74＊CD3 2.67±1.22 2.83±1.45 3.37±1.79 3.47±1.89 0.18 NKG2D 3.17±1.20 10.77±1.20a26.80±1.39ab32.83±1.29abc3.51＊CD19 2.10±1.57 2.33±1.46 2.50±1.32 3.33±1.89 0.34 NKp46 3.67±1.97 11.70±1.13a21.57±2.12ab29.53±2.40abc3.98＊CD34 60.67±2.25 29.43±3.16a20.53±2.28ab12.13±2.01abc3.21＊

2.3LDH細胞毒性法檢測誘導分化的NK細胞殺傷能力同一效靶細胞比例，誘導分化28 d的NK細胞的殺傷能力與誘導分化21 d差異均無統(tǒng)計學意義。同一誘導分化時間，8∶1、4∶1、2∶1和1∶1組NK細胞殺傷能力均依次降低（均P＜0.05），見表2。

Tab.2　Comparison of killing activity of NK cells detected by LDH method between at 21-d group and 28-d group表2　LDH細胞毒性法檢測誘導分化21 d和28 d的NK細胞殺傷能力比較　（n=8，%，±s）

Tab.2　Comparison of killing activity of NK cells detected by LDH method between at 21-d group and 28-d group表2　LDH細胞毒性法檢測誘導分化21 d和28 d的NK細胞殺傷能力比較?。╪=8，%，±s）

組別8∶1（1）4∶1（2）2∶1（3）1∶1（4）F 21 d 45.17±2.29 23.91±3.33a15.35±3.56ab10.18±3.73abc2.66＊28 d 49.91±2.76 27.99±2.32a19.17±2.82ab13.84±3.43abc3.25＊t2 .291.741.451.25

2.47AAD/CFSE標記法誘導分化的NK細胞殺傷能力同一效靶細胞比例，誘導分化28 d的NK細胞的殺傷能力與誘導分化21 d差異均無統(tǒng)計學意義。同一誘導分化時間，8∶1、4∶1、2∶1和1∶1組NK細胞殺傷能力均依次降低（均P＜0.05），見表3。

Tab.3　Comparison of killing activity of NK cells detected by 7AAD/CFSE between 21-d group and 28-d group表3　7AAD/CFSE標記法檢測誘導分化21 d和28 d的NK細胞殺傷能力比較　（n=8，%，±s）

Tab.3　Comparison of killing activity of NK cells detected by 7AAD/CFSE between 21-d group and 28-d group表3　7AAD/CFSE標記法檢測誘導分化21 d和28 d的NK細胞殺傷能力比較?。╪=8，%，±s）

組別8∶1（1）4∶1（2）2∶1（3）1∶1（4）F 21 d 31.30±1.11 22.93±1.17a13.97±1.59ab8.53±1.60abc8.76＊28 d 40.87±1.12 28.57±1.46a16.47±0.81ab9.47±0.74abc3.81＊t 1.05 1.73 1.42 2.17

3　討論

臍帶血中富含CD34+HSCs，來源廣泛，操作方便，易在體外培養(yǎng)和擴增［5］。Mantri等［6］研究顯示，從臍帶血中富集的CD34+HSCs在添加SCF和Flt3L的培養(yǎng)基中可以大量擴增，并維持低分化的狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，從臍帶血富集的CD34+HSCs，體外培養(yǎng)過程中顯示出很強的增殖能力，從生長曲線中可知其倍增時間約為24 h。在相應細胞因子的刺激下，細胞形態(tài)發(fā)生變化，由懸浮狀態(tài)變?yōu)橘N壁狀態(tài)。提示本研究所獲取的CD34+HSCs可以在體外大量擴增并進行分化，為其臨床應用提供實驗依據(jù)。

既往研究發(fā)現(xiàn)CD34+HSCs可以在體內(nèi)和體外分化為NK細胞［7］。Cany等［8］通過體內(nèi)實驗觀察到，CD34+HSCs可以在淋巴細胞缺陷的 NOD/SCID/ IL2Rg（null）小鼠體內(nèi)分化為NK細胞，并具有殺死腫瘤細胞的能力。Montaldo等［9］研究顯示，在添加SCF、Flt3L和IL-15等細胞因子的培養(yǎng)基中，CD34+HSCs可以分化為NK細胞，通過體內(nèi)和體外殺傷實驗證明了分化得到的NK細胞具有殺死腫瘤細胞的能力。這些研究為NK細胞應用于臨床提供了依據(jù)。

本研究顯示，臍帶血來源的CD34+HSCs在體外可以定向分化為NK細胞，在含有20 μg/L的Flt3L、SCF、IL-7、IL-15和IL-21細胞因子的培養(yǎng)基中，細胞大量增殖，細胞數(shù)由起始的4.0×105擴增到8.96× 106；細胞增殖的同時進行分化，大部分細胞表達NK細胞表面標志性抗原CD56、NKG2D以及NKp46。分化進程中，T細胞表面標志性抗原CD3以及B細胞表面標志性抗原CD19的表達量無明顯上升，而NK細胞表面標志性抗原CD56隨著分化進程延長，表達量持續(xù)升高，同擴增初期相比，其表達量增加了3倍。提示本研究所采取的體外分化方法可以使CD34+HSCs只分化為NK細胞，而不會分化為T或B細胞。作為與NK殺傷功能需密切相關的表面抗原NKG2D和NKP46，在分化后期也開始大量表達，LDH細胞毒性檢測法和7AAD/CFSE標記法結(jié)果均顯示，分化得到的NK細胞具有殺傷功能，且殺傷能力隨效靶比增加而增加。提示本研究利用CD34+HSCs分化得到的NK細胞具有殺傷腫瘤細胞能力。

Vacca等［10］研究發(fā)現(xiàn)CD34+HSCs與基質(zhì)細胞共培養(yǎng)可以得到更高比例的NK細胞，且分化進程相對縮短。本研究得到的NK細胞雖然具有一定的殺傷能力，但殺傷效率偏低。Dungan等［11］研究顯示，內(nèi)源性干擾素（IFN）-γ可提高NK細胞的殺傷能力。Konievic等［12］通過體外實驗證明，添加外源性IFN-γ后，細胞增殖和殺傷能力均增加。因此，NK細胞體外分化的培養(yǎng)環(huán)境和細胞因子的種類會對其分化進程及功能產(chǎn)生重要的影響，具體作用機制尚需進一步研究。

（圖1見插頁）

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（2014-10-01收稿2014-10-30修回）

（本文編輯陳麗潔）

The efficiency and function detection of NK cell differentiation from human umbilical cord hematopoietic stem cells in vitro

LUO Qi1，YIN Jie2，LI Yang2，HUANG Shan2，WANG Xi2，HE Jinghua1△
1 Department of Pharmacology，College of Basic Medicine，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Cell Biology，College of Basic Medicine，Tianjin Medical University
△Corresponding AuthorE-mail：hejinghuacn@163.com

ObjectiveTo detect the efficiency and function of NK cell differentiation from human umbilical cord hematopoietic stem cells（HSCs）in vitro.MethodsCD34+hematopoietic stem cells were isolated from human umbilical cord blood，and inoculated into SCGM medium containing 20 μg/L FMS like tyrosine kinase 3 ligand（Flt-3L），stem cell factor（SCF），interleukin（IL）-7，IL-15 and IL-21.And CD34+HSCs were differentiated into NK cells in directional inducing. The growth state of cells was observed.The expressions of CD56，NKG2D，NKp46，CD3，CD19 and CD34 were detected by flow cytometry in the differentiation of 7，14，21 and 28 d.In the differentiation of 21 d and 28 d，the differentiation cells were used as effector cells，and K562 cells as target cells.The ratios of effector cells and target cells were 8∶1，4∶1，2∶1 and 1∶1.The killing activity of the differentiated cells was detected by lactate dehydrogenase（LDH）cell toxicity assay and 7AAD/CFSE labeling method.ResultsCD34+HSCs derived from human umbilical cord blood can proliferate in vitro under appropriate condition.There were no significant differences in the expression of CD3 and CD19 between different differentiation stages（7，14，21 and 28 d，P＞0.05）.The expressions of CD56，NKG2D and NKp46 were significantly different（P＜0.05），and the ultimate expression amount was（72.57±1.60）%，（32.83±1.29）%and（29.53±2.40）%.The expression of CD34 decreased gradually，and the lowest was（12.13±2.01）%.The maximum killing activity detected by LDH cell toxicity assay and 7AAD/CFSE labeling method reached（49.91±2.76）%and（40.87±1.12）%.The killing activity of NK cells was decreased in the order of 8∶1，4∶1，2∶1 and 1∶1 groups（P＜0.05）.There was no significant difference in the killing activity between NK cells of 28 d and 21 d.ConclusionHuman umbilical cord hematopoietic stem cells can differentiate into NK cells un-der appropriate conditions in vitro，and the NK cells induced from differentiation are with killing activity.

fetal blood；hematopoietic stem cells；killer cells，natural；immunophenotyping；cytotoxicity tests，immunologic；CD34+hematopoietic stem cells；in vitro differentiation；cytotoxicity

R392

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.001

973國家重大科學研究計劃資助項目（2014CB910104）；國家自然科學基金資助項目（81171899）

1天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室（郵編300070）；2天津醫(yī)科大學細胞生物學系

羅琦（1990），女，碩士在讀，主要從事腫瘤與免疫藥理學方面研究

△E-mail：hejinghuacn@163.com