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    糖基化改造β-葡萄糖醛酸苷酶的熱穩(wěn)定性

    2015-08-22 11:07:14王小艷樊艷爽韓蓓佳馮旭東李春
    化工學(xué)報 2015年9期
    關(guān)鍵詞:糖基醛酸糖基化

    王小艷,樊艷爽,韓蓓佳,馮旭東,李春,

    (1天津大學(xué)化工學(xué)院,天津 300072;2北京理工大學(xué)生命學(xué)院,北京100081)

    引 言

    大量研究表明糖基化是調(diào)節(jié)酶活性和穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素,可以賦予許多蛋白質(zhì)有益屬性和功 能[1-4]。蛋白質(zhì)經(jīng)糖基修飾后能避免熱力學(xué)降解,提高其熱穩(wěn)定性,而天然糖基化蛋白質(zhì)的糖基側(cè)鏈的去除會降低其熱力學(xué)穩(wěn)定性,從而增加蛋白質(zhì)聚集的可能性[5-6]。例如,糖基化在維持組織蛋白酶E穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用,潛在糖基化位點的去除導(dǎo)致了組織蛋白酶E對熱和酸穩(wěn)定性的下降[7]。Fonseca- Maldonado等[8]發(fā)現(xiàn),畢赤酵母中重組表達(dá)的糖基修飾的木聚糖酶與大腸桿菌中表達(dá)的未發(fā)生糖基化的對照酶相比熱穩(wěn)定性得到顯著提高。研究表明,糖基化可提高彈性蛋白酶rPAEd 在有機(jī)溶劑中的穩(wěn)定性,使其在70℃時的半衰期延長至32.2 min, 與未糖基化的對照(23.1 min)相比熱穩(wěn)定性有了顯著改善[5]。另外,由于糖鏈自身的親水性,經(jīng)過糖基化修飾后蛋白質(zhì)的水溶性可能會發(fā)生變化,有利于一些糖蛋白的分泌[9]。由于糖基化具有賦予蛋白質(zhì)有益特性和功能的潛力,近年來糖基化在蛋白質(zhì)改造方面得到越來越廣泛的關(guān)注。

    真核生物中N-糖基化識別位點主要有N-X-T和N-X-S兩種形式,研究發(fā)現(xiàn)N-X-T結(jié)構(gòu)比N-X-S結(jié)構(gòu)更容易被糖基化[10]。但很多自然界蛋白質(zhì)存在自身含有的潛在糖基化位點并未被糖基修飾的現(xiàn)象,有研究表明,位于蛋白結(jié)構(gòu)反向轉(zhuǎn)角區(qū)上的糖基化位點天冬酰胺前面2~3個位置的氨基酸為苯丙氨酸時,有利于芳香族側(cè)鏈和糖鏈的N-乙酰葡糖胺相互作用,從而提高糖基化效率,該特征氨基酸序列主要有3種形式:F-N-X-T、F-X-N-X-T和F-X-X-N-X-T,具有該特征的序列被稱為EAS(enhanced aromatic sequon)序列[11-12]。而隨著對糖基修飾和糖蛋白之間關(guān)系的研究,發(fā)現(xiàn)將N-糖鏈引入蛋白質(zhì)適當(dāng)?shù)亩壗Y(jié)構(gòu)中能增加其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。因此通過定點突變來減少或增加糖基化位點,對探索N-糖基化對全局糖蛋白的影響是一種有效手段。

    β-葡萄糖醛酸苷酶(GUS,EC 3.2.1.31)屬于糖苷酶,大部分屬于糖基水解酶第二家族,它能催化各種類型的β-葡萄糖醛酸苷水解產(chǎn)生多種衍生物同時釋放出β-葡萄糖醛酸[13]。相關(guān)研究表明,該酶可以轉(zhuǎn)化甘草酸(GL)生成單葡萄糖醛酸甘草次酸(GAMG)[14-18],且與GL相比,GAMG具有極性適中、安全性更高及生物利用度更高等優(yōu)點,更能滿足工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的需求。前期將來自Penicillium purpurogenumLi-3菌中的β-葡萄糖醛酸苷酶在畢赤酵母中重組表達(dá)后發(fā)現(xiàn)其發(fā)生了糖基修飾,而經(jīng)糖基修飾后的β-葡萄糖醛酸苷酶(PGUS-P)的熱穩(wěn)定性與野生型相比得到明顯提高[19]。

    考慮到糖基化對糖蛋白熱穩(wěn)定性的顯著影響,本研究以PGUS-P為研究對象,基于結(jié)構(gòu)模擬對其進(jìn)行半理性設(shè)計,通過定點突變技術(shù)在該酶的氨基酸序列中引入具有EAS序列的新N-糖基化位點,并對突變酶進(jìn)行活性檢測和糖基化驗證,同時對突變酶的催化特性和熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析,以期得到含有不同位點糖基化的熱穩(wěn)定性提高的β-葡萄糖醛酸苷酶,同時也為將來對其他工業(yè)用酶穩(wěn)定性的改造提供一種新思路和理論基礎(chǔ)。

    1 實驗材料與方法

    1.1 菌株與質(zhì)粒

    表達(dá)宿主畢赤酵母P.pastorisGS115和大腸桿菌BL21(DE3)Star為本實驗室自行保藏。用于分子克隆實驗的克隆宿主為(E.coli)Top10購自博邁德公司,畢赤酵母和大腸桿菌的表達(dá)質(zhì)粒模板為潛在糖基化位點突變了的pGAPZ-Pgus-ungly和pET28a-Pgus-ungly(圖1),為實驗室自行構(gòu)建保存。

    圖1 質(zhì)粒示意圖 Fig.1 Schematic diagram of plasmid

    1.2 酶和試劑

    PCR相關(guān)試劑如rTaq DNA聚合酶等購自TaKaRa公司;凝膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自北京博邁德科技發(fā)展有限公司;限制性內(nèi)切酶,如BlnI、DpnI等購自TaKaRa公司。

    1.3 微生物的培養(yǎng)

    大腸桿菌的培養(yǎng):采用 LB培養(yǎng)基,37℃,搖床轉(zhuǎn)速170 r·min-1時培養(yǎng)12 h。

    畢赤酵母P.pastorisGS115的培養(yǎng):采用YPD培養(yǎng)基,30℃,搖床轉(zhuǎn)速170 r·min-1,培養(yǎng)3 d。

    1.4 定點突變

    ①以質(zhì)粒為模板,利用表1中的引物克隆整個質(zhì)粒,同時在目標(biāo)基因上引入突變位點;②PCR產(chǎn)物可直接利用DpnI消化甲基化或半甲基化的模板;③將酶切產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞中;④篩選到陽性克隆、測序正確后將質(zhì)粒在表達(dá)宿主中表達(dá)。

    表1 引物序列表 Table 1 Primers sequence table

    1.5 突變酶的表達(dá)

    大腸桿菌的表達(dá)體系構(gòu)建與突變酶的表達(dá)參照Merck Novagen 的pET表達(dá)系統(tǒng)說明書。

    畢赤酵母P.pastorisGS115的表達(dá)體系構(gòu)建與突變酶的表達(dá)根據(jù)Invitrogen公司pGAPZ表達(dá)載體操作手冊進(jìn)行操作。

    1.6 重組蛋白的純化及SDS-PAGE分析

    大腸桿菌表達(dá)蛋白的純化采用Ni Fast Flow鎳柱親和色譜柱進(jìn)行;畢赤酵母表達(dá)蛋白的純化采用Q Sepharose Fast Flow強(qiáng)陰離子交換柱進(jìn)行;蛋白質(zhì)的丙酮沉淀,向培養(yǎng)基中加入等體積的預(yù)冷的丙酮,輕輕混勻后,4℃,12000 r·min-1離心10 min,收集蛋白沉淀,最后加入適量的緩沖液溶解蛋白。SDS-PAGE分析,樣品處理:取樣品40 μl加入10 μl蛋白上樣緩沖液重懸,在沸水浴中煮沸5 min后離心后取上清電泳;制膠,參考說明書配制10%的分離膠和5%的濃縮膠;電泳:初始電壓控制在80 V,等樣品泳過濃縮膠后將電壓調(diào)節(jié)到120 V直至電泳結(jié)束;染色和脫色:將凝膠剝下后用考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色1 h,然后用脫色液脫色,期間換脫色液1~2次,脫色充分后拍照保存。

    1.7 糖蛋白PAS染色

    PAS( periodic acid-Schiff’s base method)染色方法:利用品紅的高碘酸-希夫試劑,通過對糖鏈染色來檢測糖蛋白的存在。取出SDS-PAGE后的凝膠,將其在10%冰醋酸-35%甲醇溶液中浸泡1~2 h以固定蛋白條帶;然后將固定后的凝膠取出用5%的冰醋酸清洗2次,每次10 min;然后把凝膠浸泡在用5%冰醋酸配制的1%的高碘酸溶液中,在4℃中黑暗條件下氧化1 h;用5%冰醋酸將凝膠漂洗幾次后,用50 ml的偏重亞硫酸鈉溶液(0.2 g偏重亞硫酸鈉溶于100 ml 5 %冰醋酸)浸泡10 min;用Schiff試劑于4℃避光染色1 h;染色完畢后將凝膠用大量5%冰醋酸進(jìn)行清洗,即可見紅色糖蛋白電泳條帶。

    1.8 糖蛋白糖苷酶F酶法

    糖苷酶F酶切條件如下:①20 μg糖蛋白在1×糖蛋白變性緩沖液中,100℃煮沸10 min,使糖蛋白變性。②加入1/10體積的10×G7緩沖液及10% NP-40。③加入1~5 μl PNase F,37℃溫育1 h,將酶切后樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

    1.9 β-葡萄糖醛酸苷酶的活性測定

    以硝基苯-葡萄糖醛酸苷(p-NPG)為底物的 酶活測定:取10 μl酶液加40 μl p-NPG(1.25 mmol·L-1)最適溫度下反應(yīng)10 min后,加入200 μl、0.4 mol·L-1的碳酸鈉終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀(405 nm)檢測樣品溶液中對硝基苯酚的含量。β-葡萄糖醛酸苷酶活力定義:一個活力單位(U)為上述條件下,每分鐘催化生成1 μmol對硝基苯酚所需的酶量。

    以甘草為底物的酶活測定:取100 μl 酶液與400 μl甘草酸緩沖溶液反應(yīng),一定溫度下反應(yīng)一段時間后,沸水浴處理10 min使酶失活,樣品與甲醇的混合比例為1:9,用HPLC檢測GL、GAMG 和GA 的含量。采用高效液相色譜外標(biāo)法對甘草酸、GAMG 和甘草次酸進(jìn)行測定,儀器設(shè)置參數(shù)為:島津LC-10A,色譜柱:Shim-pack,VP-ODS,檢測器:SPD,檢測波長:254nm,流動相:甲醇:0.6%乙酸=81:19,進(jìn)樣量:10 μl,流速:1 ml·min-1,柱溫箱:40℃,工作站:LCsolution。β-葡萄糖醛酸苷酶活力定義為:在一定條件下,每分鐘消耗1 nmol 的甘草酸所需要的酶量為一個活力單位。

    1.10 突變酶催化特性的測定

    溫度穩(wěn)定性:將β-葡萄糖醛酸苷酶液放于65℃水浴中保溫,分別在不同時間間隔取樣,測定剩余酶活力,以初始酶活作為參照,確定β-葡萄糖醛酸苷酶的溫度穩(wěn)定性。

    動力學(xué)常數(shù)的測定:在最適pH條件下配制0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 g·L-1的甘草酸溶液,取一定量的酶液與甘草酸溶液在40℃反應(yīng),10 min后,進(jìn)行酶活檢測。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計算酶動力學(xué)參數(shù)。

    1.11 結(jié)構(gòu)模擬分析

    蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模擬采用SWISS-MODEL進(jìn)行同源建模,模板選取已經(jīng)公布的大腸桿菌來源的β-葡萄糖醛酸苷酶蛋白三維晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號:3K46)[20],結(jié)構(gòu)顯示分析均采用PyMol軟件完成。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 N-糖基化位點的設(shè)計

    根據(jù)PGUS-P氨基酸序列(Genebank 登錄號為EU095019),對其一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析選取目標(biāo)N-糖基化位點。首先,為提高新糖基化位點發(fā)生糖基修飾的可能性,選擇最易將其突變成為具有EAS(enhanced aromatic sequence)序列特征的糖基化位點,其次兼顧改變較少氨基酸即可形成EAS序列的原則,初期選取了10個目標(biāo)N-糖基化位點。

    為進(jìn)一步分析新設(shè)計的糖基化位點是否合理,以已經(jīng)公布的大腸桿菌來源的β-葡萄糖醛酸苷酶蛋白三維晶體結(jié)構(gòu)為模板(PDB編號:3K46)[20],利用SWISS-MODEL對PGUS-P的結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模,并結(jié)合PyMOL蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析軟件對PGUS-P三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行展示與分析。從蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)上來說,糖基化在loop/turn區(qū)發(fā)生概率較高[21],進(jìn)一步從初期選取的10個目標(biāo)N-糖基化位點中選取位于loop/turn區(qū)的突變位點;而從蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)上分析,避免選取位于蛋白質(zhì)亞基結(jié)合面,且靠近活性中心的序列,最終確定了3個位于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)表面且遠(yuǎn)離活性中心同時位于loop/turn區(qū)的目標(biāo)序列突變?yōu)镋AS序列,其突變序列見表2,這3個新的糖基化位點在PGUS-P蛋白結(jié)構(gòu)上的位置分布情況如圖2所示。

    表2 目標(biāo)突變序列 Table 2 Targeted sequon

    從圖2中可見,1號目標(biāo)突變EAS序列位于氨基酸序列的26~30之間,該段氨基酸序列位于PGUS-P三維結(jié)構(gòu)中的糖基結(jié)合保守域,將其命名為PGUS-P-26;同樣位于該區(qū)域的還有2號目標(biāo)突變EAS序列(氨基酸序列35~39),將其命名為PGUS-P-35;而3號(命名為PGUS-P-259)則位于免疫球蛋白β-三明治狀結(jié)構(gòu)域。

    圖2 突變位點在β-葡萄糖醛酸苷酶三維結(jié)構(gòu)上的位置分布 Fig.2 Location of EAS on subunit form of PGUS-P (a) [E414 and E505 (labeled in red) were two presumed activity catalytic residues] and location of EAS on tetramer form of PGUS-P (b)

    圖3 PGUS-P-26,PGUS-P-35和PGUS-P-259與PGUS-P蛋白結(jié)構(gòu)比對 Fig.3 Structural alignment of mutant enzymes and PGUS-P (Red and yellow represent sequence before and after mutation, respectively)

    為考察3個目標(biāo)突變位點氨基酸的突變是否引起PGUS-P結(jié)構(gòu)的改變,利用SWISS-MODEL將突變后的序列重新建模,將PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259建模后的結(jié)構(gòu)與PGUS-P進(jìn)行疊合比對,分析新糖基化位點對β-葡萄糖醛酸苷酶本身結(jié)構(gòu)的影響。疊合比對結(jié)果如圖3所示,由圖3可以看出,與PGUS-P結(jié)構(gòu)相比,只有PGUS-P-26的氨基酸改變導(dǎo)致了蛋白局部結(jié)構(gòu)的變化,但并未引起蛋白三級結(jié)構(gòu)的變化,而PGUS-P-35和PGUS-P-259的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在氨基酸改變前后并未發(fā)生變化。進(jìn)一步說明新設(shè)計的3個糖基化位點進(jìn)行N-糖基修飾是合理可行的。

    2.2 突變酶的表達(dá)及糖基化驗證

    選擇了適度甘露糖糖鏈的畢赤酵母對目標(biāo)突變序列進(jìn)行糖基修飾的底盤宿主,同時選擇了組成型分泌表達(dá)載體pGAPZa通過定點突變成功構(gòu)建了3個突變酶的畢赤酵母表達(dá)體系。經(jīng)培養(yǎng)表達(dá)后利用丙酮沉淀法對培養(yǎng)液上清中的蛋白進(jìn)行初步濃縮,用SDS-PAGE進(jìn)行檢測目標(biāo)蛋白是否表達(dá),從圖4的結(jié)果可以看出,3個突變酶均獲得了成功表 達(dá),突變酶蛋白條帶大小均與原始PGUS-P的蛋白分子量大小相同。

    圖4 突變酶SDS-PAGE檢測分析 Fig.4 SDS-PAGE of crude enzyme from Picha pastoris

    為驗證3個含有新N-糖基化位點的突變酶是否都成功引入糖基修飾,首先選擇糖蛋白分析中較為常用的PAS染色。將SDS-PAGE后的凝膠進(jìn)行PAS染色,從3個突變酶的PAS染色結(jié)果[圖5(a)]中可以看出,PGUS-P及3個突變酶均能觀察到紫紅色條帶,而大腸桿菌中表達(dá)β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E泳道則沒有紫紅色條帶出現(xiàn)。為了進(jìn)一步觀察目標(biāo)條帶的變化,將PAS染色后的凝膠重新進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色,結(jié)果如圖5(b)所示,經(jīng)藍(lán)染后,目標(biāo)位置出現(xiàn)明顯條帶,而原本無條帶的PGUS-E也出現(xiàn)藍(lán)色條帶。以上結(jié)果可以初步確定3個突變體均成功引入糖基化修飾。

    為了更進(jìn)一步確認(rèn)突變酶發(fā)生了糖基修飾,采用了糖苷酶F作為去糖鏈劑來處理目標(biāo)酶樣品。酶切前后樣品分別進(jìn)行SDS-PAGE,檢測糖苷酶處理前后分子量變化,SDS-PAGE結(jié)果見圖6。從結(jié)果中可以看出,3個突變酶糖苷酶F酶切前后條帶均發(fā)生遷移,表明酶切后由于糖鏈的去除,分子量發(fā) 生了變化。酶切前大小與自身含有糖基化的PGUS-P一致,而酶切后大小則與無糖基化的PGUS-E大小保持一致,糖苷酶F酶切結(jié)果表明3個突變酶均發(fā)生了糖基修飾。

    圖5 突變酶的PAS染色 Fig.5 SDS-PAGE of mutants stained by PAS

    圖6 糖苷酶F處理前后SDS-PAGE電泳圖 Fig.6 SDS-PAGE analysis of mutant enzymes treated with/without PNGase F

    2.3 突變酶的催化特性分析

    為檢測獲得的突變酶是否具有活性,對純化得到的突變酶樣品進(jìn)行了以p-NPG為底物的酶活檢查,如圖7所示,發(fā)現(xiàn)不同糖基化位點比酶活呈現(xiàn)較大差異。PGUS-P -35的比酶活為141.5 U·mg-1,明顯高于對照PGUS-P的106.1 U·mg-1,PGUS-P-259與PGUS-P相比也有所提高,為125.5 U·mg-1,而PGUS-P-26的比酶活卻下降為60.07 U·mg-1。此種現(xiàn)象可能與發(fā)生糖基化的位點不同有關(guān)系,PGUS-P-26的突變位點的糖基修飾可能影響到了酶的正?;钚詫?dǎo)致其比酶活下降。Miller等曾報道過當(dāng)把endothelial lipase(EL)的N373、N449和N471位的糖鏈去除后,EL的酶活降低了70%,但去除N62位的糖鏈,EL的酶活反而提高了5倍[22-23],也說明了不同糖基化位點對酶活的影響不同。

    圖7 畢赤酵母表達(dá)突變酶的比酶活測定 Fig.7 Specific activity analysis of mutant enzymes expressed in P.pastoris

    利用HPLC分析考察了突變酶水解甘草酸模式(催化特異性)有無發(fā)生變化,圖8顯示了各突變酶水解甘草酸反應(yīng)的結(jié)果。甘草酸(GL)為底物,產(chǎn)物為單葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)和甘草次酸(GA),三者的保留時間分別為5.2 min,11.6 min和21.3 min[24]。從圖8的結(jié)果可以看出,PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259對甘草酸的水解模式均未發(fā)生變化,與對照PGUS-P一樣生成GAMG和GA兩種產(chǎn)物。表明不同位點糖基化修飾不會改變β-葡萄糖醛酸苷酶的催化反應(yīng)類型。該結(jié)論與江南大學(xué)余曉斌課題組報道的N-糖基化對彈性蛋白酶的底物特異性沒有顯著影響是一致的[5]。

    圖8 突變酶水解甘草酸(GL)的模式 Fig.8 Hydrolysis of glycyrrhizin by mutant enzymes

    表3 突變酶與甘草酸反應(yīng)的動力學(xué)常數(shù) Table 3 Kinetic parameters of mutant enzymes in GL hydrolysis

    大多數(shù)情況下,發(fā)生了N-糖基化的蛋白質(zhì)的催化特性要優(yōu)于與其對應(yīng)的沒有被糖基修飾的蛋白,盡管有時候糖基修飾并未引起蛋白結(jié)構(gòu)的顯著改變[25]。糖鏈的添加可能通過影響酶蛋白環(huán)狀結(jié)構(gòu)域與催化殘基的相互作用來影響酶與底物之間的親和力[26]。為了考察新引入糖基修飾的突變酶在實際催化反應(yīng)體系中的催化性質(zhì),采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法計算酶反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)(Km,Vmax,Kcat,Kcat/Km),結(jié)果如表3所示。PGUS-P-35的最大反應(yīng)速率Vmax與PGUS-P相比得到提高,為120.48 μmol·(L·min)-1。三者的Km和Kcat與PGUS-P相比均減小,說明新引入的糖基化不同程度地提高了β-葡萄糖醛酸苷酶與甘草酸底物的親和力,可能是糖基修飾使得酶蛋白空間構(gòu)象更有利于底物的結(jié)合,而且3株突變酶PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259的Kcat/Km與PGUS-P相比分別提高了30.1%,23.9%和12.6%,表明其催化底物甘草酸的效率同時也得到提高。

    2.4 突變酶熱穩(wěn)定性分析

    大量研究表明,N-糖基化可以提高蛋白的穩(wěn)定性,其原因主要有兩個:一是糖鏈的形成可以降低未折疊蛋白的無序度,即提高了一些未折疊的糖蛋白的穩(wěn)定性;二是由于糖鏈本身是一些分子量較大的親水基團(tuán),會增加蛋白的可溶性并且有利于抑制蛋白聚集體的形成[27]。另外,也有研究表明,雖然有時候一些糖蛋白的糖基化并沒有顯著改變蛋白的二級結(jié)構(gòu),但會減緩其熱失活過程,一定程度上抑制了熱變性過程中蛋白的聚集[28],這也進(jìn)一步證明了糖基化可提高蛋白穩(wěn)定性。為驗證不同位點新引入的N-糖基化對β-葡萄糖醛酸苷酶熱穩(wěn)定性的影響,首先在大腸桿菌中表達(dá)了相應(yīng)的含有這3個突變序列的 β-葡萄糖醛酸苷酶,分別命名為PGUS-E-26、PGUS-E-35和PGUS-E-259,然后同時考察了有糖基修飾的PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259和無糖基修飾的 PGUS-E-26、PGUS-E-35和PGUS-E-259在65℃時的熱穩(wěn)定性。將酶液置于65℃水浴中,每隔30 min時間間隔取樣,測定酶活,以保溫前的酶活為對照并記為100%,測定結(jié)果如圖9所示。

    在65℃保溫時,糖基化突變酶PGUS-P-35和PGUS-P-259的熱穩(wěn)定性與對照PGUS-P相比得到提高。65℃保溫90 min時,二者剩余酶活力分別維持在95%和93%,而PGUS-P剩余酶活為84%左右。但PGUS-P-26在65℃ 保溫90 min時的剩余酶活僅為74%左右。繼續(xù)延長保溫時間可以發(fā)現(xiàn),PGUS-P-35,PGUS-P-259兩突變體的剩余酶活下降非常緩慢,3 h后仍然保留高達(dá)85%以上的剩余酶活,而PGUS-P只保留70%以上的酶活。且糖基化系統(tǒng)中表達(dá)的 PGUS-P-26,PGUS-P-35和PGUS-P-259熱穩(wěn)定性均顯著高于非糖基化系統(tǒng)中的表達(dá)的相應(yīng)酶,上述結(jié)果表明糖基修飾提高了該酶的熱穩(wěn)定性。

    此外,從圖9(a)可以看出,PGUS-E-26與其對照PGUS-E相比提高約10%,表明該位點的氨基酸突變有利于熱穩(wěn)定性的提高,但糖基修飾的PGUS-P-26的熱穩(wěn)定性卻低于對照PGUS-P,原因可能是該位點的糖基修飾影響了酶的局部結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其穩(wěn)定性降低。而PGUS-E-35和PGUS-E-259的熱穩(wěn)定性與PGUS-E相比并未有顯著變化趨勢[圖9(b),(c)],說明相應(yīng)位點的氨基酸突變對穩(wěn)定性影響不大,但糖基修飾的PGUS-P-35和PGUS-P-259熱穩(wěn)定性與對照PGUS-P相比明顯提高,進(jìn)一步說明二者的熱穩(wěn)定性提高確實是由引入的糖基化引起的。上述結(jié)果表明糖基化對β-葡萄糖醛酸苷酶的熱穩(wěn)定性有顯著影響,且不同位點的糖基化對該酶的影響有明顯差異,這與文獻(xiàn)中報道的不同位點上的糖基化對酶具有明顯不同影響的結(jié)論是一致的[8]。

    3 結(jié) 論

    本研究以糖基修飾作為一種新的酶穩(wěn)定性改造手段,以畢赤酵母重組表達(dá)PGUS-P為研究對象,在對PGUS-P結(jié)構(gòu)模擬的基礎(chǔ)上,采用半理性設(shè)計方法對其進(jìn)行糖基改性,利用定點突變方法在β-葡萄糖醛酸苷酶氨基酸序列中引入3個具有EAS序列的新N-糖基化位點,經(jīng)活性檢測和PAS染色及糖苷酶F酶切分析,獲得了糖基修飾的突變酶PGUS-P-26、PGUS-P-35、PGUS-P-259。研究發(fā)現(xiàn)引入糖基化后得到了穩(wěn)定性優(yōu)良的兩株突變酶PGUS-P-35和PGUS-P-259,65℃ 保溫90 min時,二者剩余酶活力分別維持在95%和93%;而PGUS-P-26的熱穩(wěn)定性無明顯變化,推測可能與之前模擬的該位點氨基酸的改變引起其結(jié)構(gòu)的細(xì)微改變有關(guān)。此外,引入糖基化后,PGUS-P-26、PGUS-P-35和PGUS-P-259對底物甘草酸的親和力均增加,催化效率分別提高了30.1%,23.9%和12.6%。本研究初步探究糖基化的位點對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及催化特性的影響,推測位于turn/loop區(qū)的糖鏈的添加可能會在一定程度上影響到一些loop環(huán)的柔性,從而改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的剛性。

    圖9 突變酶熱穩(wěn)定性分析 Fig.9 Thermostability analysis of mutant enzymes

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