低氧預(yù)處理對人脂肪來源干細(xì)胞增殖和分化潛能影響的研究

劉林奇, 魯 峰, 王 量, 黃書鵬, 李 樂, 李世榮

低氧預(yù)處理對人脂肪來源干細(xì)胞增殖和分化潛能影響的研究

劉林奇, 魯 峰, 王 量, 黃書鵬, 李 樂, 李世榮

目的 探討低氧(1%氧濃度)對脂肪來源干細(xì)胞增殖及分化潛能的影響。方法 用酶消化法培養(yǎng)脂肪來源干細(xì)胞；低氧預(yù)處理人脂肪來源干細(xì)胞于1%氧濃度下，48 h后檢測脂肪來源干細(xì)胞的增殖情況及MTT法檢測處理后各時間點的細(xì)胞活性,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物，三系誘導(dǎo)后檢測成脂、成軟骨、成骨分化潛能。結(jié)果 低氧預(yù)處理促進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞增殖、并不改變其間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90(99.92%±0.30%)和CD105(99.91%±0.04%)，低表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志CD31(0.48%±0.32%)，低氧預(yù)處理能促進(jìn)成脂、成軟骨，但對成骨無影響。結(jié)論 缺氧預(yù)處理能提高脂肪來源干細(xì)胞的增殖及活性，間充質(zhì)干細(xì)胞特性，為細(xì)胞療法臨床運用及組織工程運用提供了新的思路。

低氧; 預(yù)處理; 脂肪來源干細(xì)胞; 分化潛能

干細(xì)胞移植在再生醫(yī)學(xué)中的運用是目前研究的熱點，而作為干細(xì)胞的重要成員----脂肪來源干細(xì)胞是從脂肪組織中分離得到的一種能夠多向分化的干細(xì)胞，具有體內(nèi)儲存量大、易于獲取、增殖穩(wěn)定等特點，逐漸成為利用干細(xì)胞治療及組織工程的種子細(xì)胞[1]。目前，對于脂肪來源干細(xì)胞的培養(yǎng)通常是在體積分?jǐn)?shù)21%氧分壓條件下完成的，而研究表明，人體各組織器官的氧分壓存在較大差異，文獻(xiàn)報道脂肪組織的氧分壓通常在3%以下，這提示脂肪來源干細(xì)胞很可能處在一個低氧濃度環(huán)境中[2-3]。因此，低氧條件下培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞成為人們關(guān)注的焦點[4-6]。自2013-2014年，我們對低氧預(yù)處理對人脂肪來源干細(xì)胞的增殖分化潛能的影響進(jìn)行了研究。

1 對象與方法

1.1 實驗儀器及材料 高糖DMEM，F(xiàn)BS，PBS液，胰蛋白酶-EDTA、青鏈霉素原液，DMSO，MTT，Ⅰ型膠原蛋白酶，抗人 CD31、CD90、CD105流式抗體，離心管，培養(yǎng)皿，吸管，96及6孔培養(yǎng)板，過濾器，普通CO2及三氣培養(yǎng)箱，流式細(xì)胞儀，超凈工作臺，倒置顯微鏡，離心機(jī)，37 ℃恒溫水箱，ELX800型通用酶標(biāo)儀，血細(xì)胞計數(shù)儀等，WH-2微型漩渦混合儀。

1.2 組織來源 脂肪來自于20～50歲要求去除腰腹部及大腿多余脂肪行抽脂術(shù)的健康成人，供體無傳染病及內(nèi)分泌疾病，男女比例為1∶3。共24例患者。術(shù)前均簽署知情同意書。

2 實驗方法

2.1 脂肪來源干細(xì)胞的培養(yǎng) 將抽吸脂肪經(jīng)過178 r/min，離心3 min后在超凈臺中轉(zhuǎn)移入50 ml離心管中，加入等體積的Ⅰ型膠原酶(0.25%)，微型漩渦混合儀混勻，放入37 ℃的水浴箱內(nèi)，每10 min漩渦10～12 s，消化30 min。加入等體積完全培養(yǎng)基(DMEM+10%胎牛血清(FBS)+1%雙抗)，48 h后更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第2代備用(生長至80%～90%)。

2.2 低氧和常氧預(yù)處理人脂肪來源干細(xì)胞 胰蛋白酶-EDTA消化第2代細(xì)胞，以1∶2傳代接種在100 mm培養(yǎng)皿內(nèi)，每100 mm皿加入7.5 ml完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞貼壁8 h后分別隨機(jī)移入低氧培養(yǎng)箱(1%O2，5%CO2,37 ℃)和常氧培養(yǎng)箱(5%CO2,37 ℃)。待氧氣濃度平衡至1%后處理48 h，常氧組細(xì)胞放入普通CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。

2.4 細(xì)胞增殖測定(MTT法) 消化法收集經(jīng)低氧和常氧處理的脂肪來源干細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板，1×103/孔，體積200 μl/孔，在常氧培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，8、24、48、72、96 h后分別加入5 g/LMTT溶液，20 μl/孔，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸去孔內(nèi)上懸液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm波長下讀取吸光值(OD)值。每次每組檢測6個孔，并根據(jù)OD值繪制細(xì)胞生長曲線。

2.5 流式細(xì)胞儀鑒定其分子表達(dá) 取兩種方法處理后的第3代細(xì)胞分別作流式細(xì)胞儀鑒定。胰酶消化細(xì)胞，每管細(xì)胞2×105，用含有0.1%疊氮鈉和0.5% BSA的PBS洗兩遍，用PBS重懸細(xì)胞。加入一抗，4 ℃30 min，PBS洗2遍。加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)或藻紅蛋白(phycoerythrin, PE)標(biāo)記的小鼠抗人IgG二抗，4 ℃30 min，PBS洗2遍。用不含BSA的PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測CD31、CD90、CD105的表達(dá)。

2.6 脂肪來源干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化 成脂誘導(dǎo)分化：為了檢測其成脂分化潛能，將兩組細(xì)胞分別接種于普通培養(yǎng)基的12孔培養(yǎng)皿培養(yǎng)。培養(yǎng)過夜細(xì)胞貼壁后，更換成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每隔3 d更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基，1周后用油紅O染色評估成脂分化程度，細(xì)胞所含脂質(zhì)染成紅色。顯微鏡照相。實驗在重復(fù)孔中進(jìn)行。油紅O染色的脂質(zhì)用異丙醇萃取，并在510 nm處測定吸光度。

成軟骨誘導(dǎo)分化：細(xì)胞用胰蛋白酶消化并以10 000細(xì)胞/孔重新接種在12孔培養(yǎng)皿。過夜細(xì)胞貼壁后，更換軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，在第3周的細(xì)胞進(jìn)行漂洗在0.1 mol/L的鹽酸(pH 1.0)平衡pH。將其放置在含有的1%阿爾新藍(lán)-8 GX的 0.1 mol/L鹽酸(pH 1.0)30 min，然后再洗滌2遍以除去非特異性染色。細(xì)胞作核固紅。最后測定結(jié)果是由兩個雙盲的學(xué)者用Image-Pro Plus 6.0分析而得。

成骨誘導(dǎo)分化：細(xì)胞用胰蛋白酶消化并以10 000細(xì)胞/孔重新接種在12孔培養(yǎng)皿，過夜細(xì)胞貼壁后，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。茜素紅染色和定量3周后進(jìn)行，在后期的成骨分化過程中，茜素紅進(jìn)行鈣沉積檢測。將培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS洗滌，固定在100%乙醇中15 min，并用0.2%茜素紅溶液(pH 6.4)處理30 min，去離子水洗滌以除去非特異性沉淀，紅色代表細(xì)胞分化的鈣沉積。用于晚期成骨分化的分析。對鈣的沉積進(jìn)行定量的茜素紅染色用100 mM氯化十六烷基吡啶萃取，在室溫下攪拌3 h。所提取茜素紅在570 nm處測定吸光度。

3 結(jié)果

3.1 低氧處理的脂肪來源干細(xì)胞形態(tài) 脂肪來源干細(xì)胞是從脂肪獲取之后，經(jīng)過酶消化法，得到血管基質(zhì)片段(stromal vascular fraction, SVF)，經(jīng)過貼壁培養(yǎng)即可得脂肪來源干細(xì)胞，從我們的實驗中，低氧預(yù)處理未改變?nèi)酥緛碓锤杉?xì)胞的形態(tài)，成纖維細(xì)胞樣長梭形。表明低氧預(yù)處理并不會對細(xì)胞形態(tài)學(xué)形成明顯影響。

3.2 低氧預(yù)處理對脂肪來源干細(xì)胞增殖能力影響 人脂肪來源干細(xì)胞處于第2代時采取隨機(jī)方式進(jìn)行分組，細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)低氧預(yù)處理和常氧培養(yǎng)。在經(jīng)過48 h的低氧預(yù)處理和常氧培養(yǎng)后，結(jié)果表明,低氧處理組的細(xì)胞數(shù)量超過常氧處理組的細(xì)胞，兩組相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。說明在低氧處理的過程中，人脂肪來源干細(xì)胞細(xì)胞增殖更快。經(jīng)過低氧預(yù)處理后，通過MTT檢測不同時間點的OD值反應(yīng)了細(xì)胞的增殖活性情況，我們的實驗結(jié)果表明，在低氧預(yù)處理之后24、48、72、96h脂肪來源干細(xì)胞的增殖能力有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。表明在低氧預(yù)處理的人脂肪來源干細(xì)胞后，低氧預(yù)處理組人脂肪來源干細(xì)胞的增殖能力較常氧組強(qiáng)，表明低氧預(yù)處理能提高其增殖能力。

3.3 低氧預(yù)處理對人脂肪來源干細(xì)胞表面標(biāo)志的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，低氧處理的人脂肪來源干細(xì)胞仍然高表達(dá)干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志物CD90(99.92%±0.30%)和CD105(99.91%±0.04%)，低表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志CD31(0.48%±0.32%)，見圖3。同時，進(jìn)行常氧培養(yǎng)的人脂肪來源干細(xì)胞同樣高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志，低表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志：CD90(99.90%±0.4%)和CD105(99.87%±0.2%)，CD31(0.52%±0.29%)，此結(jié)果證明，在低氧預(yù)處理的脂肪來源干細(xì)胞未改變其干細(xì)胞的特性，持續(xù)高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志物，維持了間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，在48h的低氧處理過程中，脂肪來源干細(xì)胞并無明顯的向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化趨向。

3.4 低氧預(yù)處理對人脂肪來源干細(xì)胞三向分化潛能的影響 經(jīng)過低氧預(yù)處理的人脂肪來源干細(xì)胞經(jīng)過一定時間的誘導(dǎo)培養(yǎng)，均能向成脂、成骨及成軟骨方向分化，同時將低氧預(yù)處理的脂肪來源干細(xì)胞和一直以常氧濃度培養(yǎng)的人脂肪來源干細(xì)胞三向分化能力對比，低氧預(yù)處理的人脂肪來源干細(xì)胞其成脂能力(P<0.05)、成軟骨能力(P<0.05)較常氧培養(yǎng)的強(qiáng)。低氧處理組有較常氧組多的脂滴被染色，更多的膠原被阿辛藍(lán)染色；其成骨能力并無明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

4 討論

氧是生物生存的必要條件，大部分組織需要氧來產(chǎn)生足夠的ATP以供組織代謝，氧濃度也是調(diào)節(jié)生物功能的重要因素[7]。傳統(tǒng)實驗的組織培養(yǎng)多在常氧下進(jìn)行，氧濃度約為21%，但事實上，人體各組織細(xì)胞生理環(huán)境的氧濃度并不一致，人體血液中氧濃度為10%～13%，人類軟骨細(xì)胞(無血管組織)生長環(huán)境的氧濃度為0～7%,人腦組織氧濃度為3%～14%，肺泡血管氧濃度約為14%，骨髓腔內(nèi)氧分壓為1%～7%[2]。因此，常氧環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞并不能完全符合細(xì)胞的生理特性，于是有研究者提出低氧培養(yǎng)的概念：即模擬細(xì)胞生理性低氧環(huán)境下對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，這樣的實驗條件更符合生理環(huán)境。

目前已經(jīng)有實驗證實，對于缺氧的組織，移植前在體外對間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行低氧預(yù)處理，可能將更有利于移植后組織損傷的修復(fù)，這一現(xiàn)象在心肌梗死等的動物模型中已初步得到證實[8-9]。經(jīng)過低氧預(yù)處理的細(xì)胞再進(jìn)入體內(nèi)后更容易耐受移植受區(qū)缺血、缺氧的環(huán)境，可能是因為在低氧預(yù)處理過程中激活人脂肪來源干細(xì)胞的缺氧誘導(dǎo)因子1α，從而導(dǎo)致其下游的促血管生長因子，如血管內(nèi)皮生長因子及堿性成纖維細(xì)胞生長因子等分泌增加，從而更有利于移植后保證移植細(xì)胞的存活，更好的發(fā)揮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。但我們也發(fā)現(xiàn)，目前對于低氧預(yù)處理的氧濃度及時間未形成廣泛的共識，氧濃度0.5%～10%，處理時間24～72 h[10-14]。從而得出了不完全一致的結(jié)果，但是主要研究結(jié)果表明，低氧預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的生物活性[15]，對于細(xì)胞分化潛能方面存在一定差異。 Valorani等[6]同樣證明，低氧培養(yǎng)不會改變脂肪來源干細(xì)胞的形態(tài)，他們在獲得血管基質(zhì)片段開始即采用兩種不同的方式對脂肪來源干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其成脂和成骨能力得到了增強(qiáng)。同時也有學(xué)者研究結(jié)果顯示，2%氧氣濃度會抑制鼠脂肪來源間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨和成軟骨分化。也有學(xué)者研究結(jié)果顯示，2%的氧氣濃度會抑制人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨和成脂分化。然而氧濃度5%則表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增值，但是表現(xiàn)出增強(qiáng)的成軟骨分化能力。因為開始預(yù)處理的階段、低氧預(yù)處理時間及細(xì)胞的不同可能導(dǎo)致了不完全相同的結(jié)論。本實驗采取1%氧濃度預(yù)處理人脂肪來源干細(xì)胞，到達(dá)細(xì)胞表面的氧氣濃度約為0.14%，使細(xì)胞更接近于其體內(nèi)的正常生理環(huán)境[16]。

圖1 常氧組和低氧組細(xì)胞數(shù)量 圖2 細(xì)胞的增殖曲線 圖3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面標(biāo)記

Fig 1 Number of hASCs in the hypoxia and normoxia groups. Fig 2 Growth curve of hASCs. Fig 3 Surface markers of hASCs by flow cytometry.

本研究證實了低氧預(yù)處理能促進(jìn)脂肪來源干細(xì)胞增殖、細(xì)胞活性，且能維持脂肪來源干細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞特性，具有良好的三向分化潛能，從而為人脂肪來源干細(xì)胞移植進(jìn)入體內(nèi)及組織工程中發(fā)揮更好地生物學(xué)效應(yīng)提供了更為有利的條件，但是，低氧預(yù)處理脂肪來源干細(xì)胞的氧濃度及處理時間需要進(jìn)一步深入系統(tǒng)的研究及規(guī)范，需要研究者更加全面地研究干細(xì)胞的周圍環(huán)境因素對其影響，從而為提高干細(xì)胞移植效率提供新的實驗和理論依據(jù)。

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Effects of hypoxia preconditioning on the proliferation and differentiation potentials of human adipose-derived stem cells

LIULin-qi,LUFeng,WANGLiang,etal.

(TheSouthwesternPlasticandAestheticSurgeryHospital,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Objective To study the effects of hypoxic preconditioning (1% O2) on the proliferation and differentiation potentials of human adipose-derived stem cells. Methods The method of enzymatic digestion was employed to isolate and culture adipose-derived stem cells．After hypoxia preconditioned (1%O2) for 48 hours, cell number was counted. MTT method was applied to evaluate the proliferation on different time points after hypoxia preconditioned for 48 hours. Flow cytometry cell was used to measure the surface markers and adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation potential were also measured after induction detected. Results Hypoxia preconditioning enhanced cell proliferation, after that hypoxia preconditioned adipose-derived stem cells have higher proliferation compared to normoxia group. We also observed that hypoxia increases their adipogenic and chondrogenic differentiation potentials not including osteogenic differentiation. Conclusion Hypoxia preconditioning can improve the proliferation of adipose-derived stem cells. At the same time maintain mesenchymal stem cell characteristics of adipose-derived stem cells. This may provides a new way of thinking for the clinical use of cell therapy and tissue engineering.

Hypoxia; Preconditionings; Adipose-derived stem cells; Differentiation potential

400038 重慶,第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院整形美容醫(yī)院(劉林奇,王 量,黃書鵬,李 樂,李世榮);南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 整形外科 (魯 峰)

劉林奇(1987-)，四川德陽人，醫(yī)師，碩士研究生.

李世榮， 400038，第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院整形美容醫(yī)院，電子信箱：zhengxing@vip.163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.04.014

R318.5

A

1673-7040(2015)04-0231-04

2014-11-26)