肺癌細(xì)胞中SOX1調(diào)控ECT2的表達(dá)

李 寧 周素貞 李素云

河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南鄭州 450008

肺癌是嚴(yán)重危害人類生命和健康的惡性腫瘤之一，也是世界范圍內(nèi)發(fā)病和死亡率最高的癌癥[1]。SOX1，即 SRY (sex determining region Y)-box 1，屬于具有high mobility group (HMG)-box結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族SOX家族的成員[2]。SOX1可以通過直接與β-catenin結(jié)合，導(dǎo)致β-catenin降解或直接抑制其功能，從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路[3-4]。我們前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)SOX1在肺癌組織中低表達(dá)，但機(jī)制尚不清楚[5]。最近研究人員發(fā)現(xiàn)，在肝癌、鼻咽癌、食管癌細(xì)胞等組織中SOX1啟動(dòng)子存在高甲基化，從而導(dǎo)致其表達(dá)缺[3，6，7]，SOX1 啟動(dòng)子甲基化在肺癌中尚未有報(bào)道。另外我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過cDNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SOX1后ECT2基因表達(dá)降低，本研究我們將探討肺癌細(xì)胞中SOX1基因啟動(dòng)子甲基化情況以及SOX1是否直接調(diào)控ECT2的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

50例原發(fā)性肺癌和癌旁組織由河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院提供。5’-雜氮-2’-脫氧胞嘧啶購(gòu)于Sigma公司，EpiTect Bisulfite Kit購(gòu)于Qiagen，Wizard DNA Clean-Up System為Promega產(chǎn)品，胎牛血清和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基均購(gòu)于Gibco公司，T載體購(gòu)于Takara公司。

1.2 細(xì)胞來源及培養(yǎng)

肺癌細(xì)胞株A-1由本試驗(yàn)室凍存。在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d換液一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 DNA亞硫酸氫鈉修飾

肺癌細(xì)胞株A-1由本試驗(yàn)室凍存。在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3d換液一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.4 甲基化特異性PCR

用甲基化特異性PCR（MSP）檢測(cè)SOX1在肺癌組織的甲基化狀態(tài)。甲基化特異性引物設(shè)計(jì)參見文獻(xiàn)[8]，PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，自動(dòng)電泳凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析。

1.5 Realtime-PCR檢測(cè)ECT2表達(dá)情況

培養(yǎng)A-1細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，轉(zhuǎn)染p-CMVSOX1或SOX1 siRNA，轉(zhuǎn)染24h后Trizol 法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。Realtime-PCR檢測(cè)ECT2表達(dá)情況，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行結(jié)果校正。引物序列參見表1。

表1 引物序列

1.6 染色體免疫共沉淀

培養(yǎng)A-1細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，轉(zhuǎn)染p-CMVSOX1，按照ChIP試劑盒抽提DNA，所需抗體分別加入SOX1抗體及IgG抗體為陰性對(duì)照，收集DNA。未加抗體組設(shè)為Input。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查出ECT2基因5’端-1000bp至+100bp序列（轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為0），設(shè)計(jì)5對(duì)引物(圖3A)，用上述5對(duì)引物通過Realtime-PCR檢測(cè)每個(gè)樣本Ct值，靶序列的 Ct值 =2(Ct of Ip’ed DNA-Ct of input)。

1.7 熒光素酶報(bào)告法

根據(jù)ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增片段為，包含SOX1結(jié)合位點(diǎn)。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序并連接至pGL3熒光質(zhì)粒，構(gòu)建pGL3-ECT質(zhì)粒，培養(yǎng)A-1細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分別轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1和pGL3-ECT質(zhì)?；騪-CMV-vector和pGL3-ECT質(zhì)粒，同時(shí)均轉(zhuǎn)染phRL-TK renilla質(zhì)粒作為內(nèi)參，通過Dual-Luciferase檢測(cè)試劑盒測(cè)熒光值。

1.8 免疫組化檢測(cè)肺癌組織中SOX1及ECT2表達(dá)情況

50例肺癌組織切片通過脫蠟、抗原修復(fù)程序后分別加入SOX1抗體及ECT2抗體，通過免疫組織試劑盒檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。免疫組化評(píng)分按照染色強(qiáng)度分為：0，1，2，3分，而染色面積則按＜5%（0分），5～25% （1分），25～50%（2分），＞50%（3分）。染色強(qiáng)度及染色面積結(jié)合算分，總分0～1分為陰性，＞1分為陽性[9]。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)數(shù)資料用x2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 原發(fā)性肺癌SOX1甲基化率

通過MSP檢測(cè)50例肺癌和相應(yīng)癌旁正常組織中SOX1的甲基化情況。發(fā)現(xiàn)35例SOX1基因出現(xiàn)甲基化（70%），正常癌旁組織未發(fā)現(xiàn)有甲基化異常（P=0.001）。圖1A為部分MSP結(jié)果。亞硫酸鹽修飾A-1細(xì)胞和一例正常肺組織的基因組DNA，對(duì)處理過的DNA進(jìn)行BSP分析，檢測(cè)SOX1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)。BSP結(jié)果顯示A-1細(xì)胞中SOX1存在高密度甲基化狀態(tài)，而對(duì)照組沒有檢測(cè)到甲基化異常（圖1B）。

圖1 A 原發(fā)性肺癌組織中SOX1啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)；B 亞硫酸鹽測(cè)序法檢測(cè)的部分結(jié)果。

2.2 SOX1調(diào)控ECT2的表達(dá)

培養(yǎng)A-1細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，轉(zhuǎn)染p-CMVSOX1或 SOX1 siRNA，Realtime-PCR檢 測(cè) ECT2表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1質(zhì)粒后，ECT2 mRNA值降低（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染SOX1 siRNA后，ECT2 mRNA值升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 過表達(dá)SOX1后A-1細(xì)胞中ECT2表達(dá)下降，而siRNA抑制SOX1后ECT2表達(dá)升高

2.3 染色體免疫共沉淀與熒光素酶報(bào)告法

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查出ECT2基因5’端-1000bp至+100bp序列（轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)為0），設(shè)計(jì)5對(duì)引物(圖3A)，培養(yǎng)A-1細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1，按照ChIP試劑盒抽提DNA，所需抗體分別加入SOX1抗體及IgG抗體為陰性對(duì)照，收集DNA。我們發(fā)現(xiàn)相對(duì)其他引物，A4靶序列的Ct值較高（P＜0.05），證明SOX1抗體與該段DNA序列可能結(jié)合（圖3B）。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)果，我們?cè)O(shè)計(jì)引物擴(kuò)增A4片段，連接入pGL3熒光質(zhì)粒。分別轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1和pGL3-ECT質(zhì)?；騪-CMV-vector和pGL3-ECT質(zhì)粒，同時(shí)均轉(zhuǎn)染phRL-TK renilla質(zhì)粒作為內(nèi)參，檢測(cè)pGL3-ECT質(zhì)粒熒光值變化。我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1質(zhì)粒的細(xì)胞pGL3-ECT熒光值明顯較轉(zhuǎn)染p-CMV-vector質(zhì)粒的細(xì)胞低（圖3C，P＜ 0.05）。

2.4 SOX1與ECT2在肺癌組織中表達(dá)負(fù)相關(guān)

20例肺癌組織表達(dá)SOX1，這20例肺癌組織中有14例ECT2的表達(dá)陰性。36例肺癌組織表達(dá)ECT2，這些組織中30例SOX1表達(dá)陰性（表2）。結(jié)果顯示SOX1與ECT2在肺癌組織中表達(dá)負(fù)相關(guān)（r=-0.433，P=0.001）。圖4為1例肺癌組織SOX1與ECT2的表達(dá)情況。

圖3 A.5對(duì)引物所擴(kuò)增的DNA片段位置。B.A4靶序列的Ct值較高（P＜0.05），說明SOX1抗體與該段DNA序列可能結(jié)合。C.轉(zhuǎn)染p-CMV-SOX1質(zhì)粒的細(xì)胞pGL3-ECT熒光值明顯較轉(zhuǎn)染p-CMV-vector質(zhì)粒的細(xì)胞低。熒光素酶報(bào)告法驗(yàn)證SOX1與A4靶序列結(jié)合，調(diào)控ECT2的表達(dá)。

表2 肺癌組織中SOX1與ECT2表達(dá)

圖4 免疫組化檢測(cè)肺癌組織SOX1與ECT2的表達(dá)（×200）

3 討論

SOX1，即 SRY（sex determining region Y）-box 1，屬于具有high mobility group（HMG）-box結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族SOX家族的成員，在胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[10]。家族中其他成員如SOX9，SOX17可以通過直接與β-catenin結(jié)合，導(dǎo)致β-catenin降解或直接抑制其功能（β-catenin是參與經(jīng)典Wnt通路的重要因子），從而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路[3,11]。在肝癌和宮頸癌細(xì)胞中，SOX1發(fā)揮抑癌基因作用，抑制細(xì)胞的增長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移能力[12]。

為進(jìn)一步了解SOX1在肺癌中的功能，以及篩選SOX1下游靶基因，我們?cè)贏-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染p-CMVSOX1，通過藥物篩選建立穩(wěn)定高表達(dá)SOX1的A-1/SOX1細(xì)胞株。我們通過基因微陣列分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)SOX1后，A-1細(xì)胞有130個(gè)基因下調(diào)，其中包括ECT2（epithelial cell transforming sequence 2）。ECT2是鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）之一，GEF促進(jìn)RhoA，Racl和Cdc42上的GDP置換為GTP，使RhoA，Racl和Cdc42等Rho GTPases活化[13-14]。目前尚未有關(guān)SOX1基因是否直接調(diào)控ECT2表達(dá)的報(bào)道。

我們首先利用MSP法檢測(cè)了50例原發(fā)性肺癌組織中SOX1的甲基化情況。其中35例SOX1基因出現(xiàn)甲基化異常75%，正常癌旁組織未發(fā)現(xiàn)有甲基化異常（P=0.001），說明該事件是腫瘤特異性的。一部分標(biāo)本可同時(shí)檢測(cè)到甲基化和非甲基化的DNA，可能是基因部分發(fā)生甲基化的緣故。DNA甲基化與腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系，腫瘤可發(fā)生許多種基因的異常甲基化，包括抑癌基因、DNA損傷修復(fù)基因及與腫瘤代謝和浸潤(rùn)相關(guān)的基因[15]。啟動(dòng)子甲基化可能是SOX1在肺癌組織低表達(dá)的重要機(jī)制。

為檢測(cè)SOX1基因是否直接調(diào)控ECT2表達(dá)，我們首先在A-1細(xì)胞中過表達(dá)SOX1。我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SOX1后A-1細(xì)胞中ECT2表達(dá)下降，而抑制SOX1后ECT2表達(dá)升高，熒光素酶報(bào)告檢查法以及染色體免疫共沉淀方法提示SOX1可直接與ECT2啟動(dòng)子結(jié)合，抑制ECT2的表達(dá)。免疫組化結(jié)果顯示SOX1與ECT2在肺癌組織中表達(dá)負(fù)相關(guān)。

ECT2在肺癌組織中高表達(dá)并且在轉(zhuǎn)移癌組織中表達(dá)更高，與肺癌細(xì)胞的分化及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。我們推測(cè)可能是因SOX1低表達(dá)，失去對(duì)ECT2的抑制，導(dǎo)致ECT2在肺癌組織中高表達(dá)。

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