β—PGG及沒食子酸在不同pH條件下含量分析

鄭仕萍 周國(guó)麗 楊曉紅 郭雪 范源

摘要：目的研究并分析1，2，3，4，6-五-0-沒食子酰-β-D-葡萄糖（p-PGG）在不同pH磷酸鹽緩沖液中的含量變化情況。方法：采用經(jīng)典恒溫法考察p - PGG在不同pH緩沖液（pH分別為2.3、4、5.6）中的水解情況，用反相高效液相色譜測(cè)定B- PGG及其水解產(chǎn)物含量并進(jìn)行分析。結(jié)果β- PGC隨著pH值的上升其含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，pH為5時(shí)含量最低，沒食子酸的含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。結(jié)論 β-PGG及沒食子酸在不同的pH條件下含量的變化提示反映了酸堿度對(duì)B- PGG水解反應(yīng)的影響，對(duì)該現(xiàn)象的研究可為中藥的養(yǎng)護(hù)、儲(chǔ)存及加工等實(shí)際應(yīng)用提供一定參考。

關(guān)鍵詞：1，2，3，4，6-五-0-沒食子酰-p-D-葡萄糖（β-PGC）沒食子酸；pH緩沖液；水解反應(yīng)

中圖分類號(hào)：R284

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1007 - 2349（ 2015） 02 - 0064 - 021，2，3，4，6-五-0-沒食子酰-p -D-葡萄糖（β-PGC）屬于水解類鞣質(zhì)，是葡萄糖與5個(gè)沒食子酸形成的酯。五倍子、余甘子、牡丹皮、赤芍、白芍等自然界的一些植物中均含有β- PGG，且在五倍子、牡丹皮、赤芍、白芍中β- PGG含量較高[1]。其對(duì)稱的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其除了具有螯合金屬離子，沉淀蛋白質(zhì)，淬滅活性氧等一般多酚類物質(zhì)的共同特點(diǎn)外，在以往的研究中還發(fā)現(xiàn)β- PGC在抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗感染、胰島素樣作用等方面有廣泛的應(yīng)用前景，而對(duì)其在不同pH下的變化研究較少[2]。因此本實(shí)驗(yàn)根據(jù)β-PGG的化學(xué)性質(zhì)及沒食子酸的穩(wěn)定性，考察β-PGG在不同pH溶液中水解產(chǎn)生沒食子酸后其含量的變化情況。1 實(shí)驗(yàn)材料與色譜條件1.1 儀器與試藥 Agilent - 1200型高效液相色譜儀；分析天平；酸度計(jì)；水浴鍋。1，2，3，4，6-五-0-沒食子酰-β-D一葡萄糖對(duì)照品（購(gòu)于四川成都普瑞法有限公司）；沒食子酸對(duì)照品（購(gòu)于昆明中檢所）；甲醇和乙腈均為色譜純，其余試劑為分析純；純凈水；磷酸鹽緩沖液（A液：磷酸0. 83 mL加水至50 mL，B液：磷酸氫二鈉7.2g，加水溶解成100 mL；取A、B不同體積配成pH為1.7的緩沖液，再用純凈水將其稀釋成pH為2、3、4、5、6的緩沖液）。1.2 色譜條件 沒食子酸色譜條件：色譜柱ZoRBAX SB -C18柱（4.6×250 mm，5 um），流動(dòng)相：甲醇和0.2%磷酸（5：95）；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：273 nm；流速：lmL/min；進(jìn)樣量：20ul。β- PGG色譜條件：色譜柱ZoRBAX SB - C18柱（4.6 x250 mm，5 um）；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；流速：l mL/min；進(jìn)樣量：20 uL；乙腈和0.1%磷酸為流動(dòng)相梯度洗脫，其洗脫條件見下表。2實(shí)驗(yàn)方法2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 β- PGG標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取對(duì)照品8 mg置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻作為儲(chǔ)備液。從中精密吸取10 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻。按上述β- PGC色譜條件分別取2、4、6、8、10、15 uL不同體積進(jìn)樣，以β- PGG的峰面積（Y）對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量（x）進(jìn)行線性回歸，得方程y=2420237x -18. 445.r=0.9998，結(jié)果表明：β- PGG峰面積值與質(zhì)量有良好的線性關(guān)系，線性范圍為0. 139～1.0428 ug。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密稱取對(duì)照品2.5 mg置于25mL容量瓶中，用50010的甲醇溶解定容至刻度，搖勻作為儲(chǔ)備液。分別精密吸取0.1、0.5、1、2、4mL于10mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即配制成濃度為1、5、10、20、40 ug/n1L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣20uL，以沒食子酸的峰而積（Y）對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)品濃度（x）進(jìn)線性回歸，得方程y=1 14. 7x+2.4554，r=0.9999，結(jié)果表明：沒食子酸峰面積值與濃度有良好的線性關(guān)系，線性范圍為l～ 10ug/mL。2.2實(shí)驗(yàn)內(nèi)容2.2.1 實(shí)驗(yàn)原理沒食子酸與葡萄糖酯化反應(yīng)產(chǎn)生的β-沒食子酰葡萄糖是合成PGG的第一個(gè)酶催化反應(yīng)活性底物，葡萄糖上的羥基進(jìn)一步與沒食子酸呈現(xiàn)一種有規(guī)律的結(jié)合方式[4]。結(jié)合順序?yàn)椋?，6-二-O-沒食子酰葡萄糖一l，2，6-三-O-沒食子酰葡萄糖一l，2，3，6-四-O-沒食子酰葡萄糖一1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰葡萄糖。沒食子酸結(jié)合在葡萄糖上是以酯鍵形式結(jié)合的，酯鍵可以在酸、堿條件下水解，兇此可以根據(jù)酯鍵的性質(zhì)水解β-PGG。水解順序與結(jié)合順序相反。沒食子酸為弱酸性物質(zhì)，在強(qiáng)氧化條件下沒食子酸降解迅速且不穩(wěn)定，當(dāng)pH值為7.O- 10.0時(shí)，沒食子酸在3h內(nèi)已完全降解，說明在堿性和中性條件下沒食子酸極不穩(wěn)定，而其在強(qiáng)酸、強(qiáng)光、高溫的條件下較穩(wěn)定[4]。據(jù)文獻(xiàn)顯示，沒食子酸在pH為2.0-6.0范圍內(nèi)比較穩(wěn)定[5]。沒食子酸降在含鹽酸的高溫液態(tài)水中的降解過程[6]：3，4，5-三羥基苯甲酸-3，4，5-三羥基苯酚（焦性沒食子酸）-3-羥基鄰苯醌一紅桔酚（2分子3-羥基鄰苯醌縮合而成）。2.2.2供試品溶液的制備 稱取對(duì)照品0.47 mg于5個(gè)10mL.容鞋瓶中，分別加入2mL pH為2、3、4、5、6的緩沖液，超聲使其溶解，再置于60～65℃水浴鍋上保存12h后用微孔濾膜（0. 45um）濾過，即得供試品溶液。2.2.3將供試品溶液分別按上述色譜條件測(cè)定B - PGG在不同pH條件下水解12 h后沒食子酸及PGG含量的變化趨勢(shì)。3結(jié)果3.1 在pH2～5的范圍內(nèi)，隨著pH值的不斷增大，β-PGG的含量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)；當(dāng)pH5～6時(shí)，β- PGG含量上升（見圖1）。pH值升高，β- PGG的水解反應(yīng)加強(qiáng)，β—PGG含量下降。β-PGG的水解反應(yīng)是可逆的，故pH值5—6時(shí)的β-PGG含量上升現(xiàn)象，可能是因?yàn)樗猱a(chǎn)生的沒食子酸又重新結(jié)合在葡萄糖的羥基上形成β- PGG所致。3.2在pH2～5的范圍內(nèi)，隨著pH值的升高，沒食子酸含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（見圖2）。pH5—6時(shí)沒食子酸的含量下降，其原因可能是沒食子酸與葡萄糖又重新酯化形成β-PGG，或者是沒食子酸進(jìn)一步形成棓酚等化合物。4結(jié)論β- PGG是含鞣質(zhì)類中藥的天然多酚類活性產(chǎn)物，通過實(shí)驗(yàn)，測(cè)定并分析β-PGG在不同pH條件下的含量變化情況，有助于了解β- PGG的化學(xué)穩(wěn)定性，為進(jìn)一步研究β—PGG的理化性質(zhì)提供一定參考。參考文獻(xiàn)：[1]王維聰，王潮，宋學(xué)英，等.44種中藥巾1，2，3，4，6-五-O-沒食子酰-β-D -葡萄糖含量的測(cè)定[J].中國(guó)中藥雜志，2008，33（6）：656 -658.[2]趙勇，王紅，王寶恩.中藥水解類鞣質(zhì)PCC的研究進(jìn)展[J].臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，12（6）：463 -465.[3]李霄，艾萍.RP - HPLC雙波長(zhǎng)法測(cè)定白芍中芍藥苷和五沒食子酰葡萄糖含量[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32（2）：123-125[4] JinhuiZhang， LiLi，Sung - Hoon Kim， Ann E.Hagerman ，Juxuan Lu An-ti-cancer， anti - diabetic and other pharmacologic and biological acLiv-ities of penta-galloyl-glucose[J].Pharm Res ，2009 ，26（9）：2066.[5]吳雪釵，于波濤，候艾林，等，沒食子酸穩(wěn)定性研究[J].西南國(guó)防醫(yī)藥，2006，16（5）：485-486.[6]張迎杰，傅杰，劉林，等沒食子酸在含鹽酸高溫液態(tài)水中的穩(wěn)定性[J].化學(xué)反應(yīng)工程與工藝，2013，29（2）：189-192.（收稿日期：2014-11-26）