三七總皂苷對大鼠急性重癥胰腺炎腺泡細胞鈣超載的調(diào)節(jié)機制2

董文志 馬加慶 劉志恒 莫小華

摘要：目的探討三七總皂苷是否降低胰腺炎大鼠胰腺組織中鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ一γ（CaMKⅡ-γ）mRNA表達，降低細胞鈣超載的程度，減輕急性重癥胰腺炎時胰腺組織的損傷。方法15只SD大鼠隨機分成假手術(shù)組（so組）、急性重癥胰腺炎組（SAP組）及三七總皂苷組（PNS組）。采用經(jīng)腸壁逆行胰膽管注射法建立急性重癥胰腺炎大鼠模型，假手術(shù)組開腹后僅翻動十二指腸。三七總皂苷組（PNS組）建模前1h使用腹腔注射三七總皂苷（50mg/mL血塞通注射液（0.1 mL/l00g）.所有實驗分組在建模24h后處死大鼠留取胰腺組織。使用流式細胞儀檢測、分析腺泡細胞內(nèi)鈣離子濃度（使用熒光強度表示鈣離子濃度），采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應檢測胰腺組織CAMKⅡ- γmRNA表達的變化，并比較各組大鼠胰腺組織病理變化。結(jié)果SAP組和PNS組胰腺組織中CAMK II -γmRNA表達顯著增高（P<0.05），PNS組較SAP組CAMKⅡ- γmRNA表達量顯著下降（P<0.05）。通過流式細胞儀檢測鈣離子濃度提示：SO組、SAP組、PNS組三組胰腺細胞內(nèi)Ca2的熒光強度具有統(tǒng)計學差異，SAP組和PNS組較so組大鼠胰腺細胞內(nèi)Ca2+的熒光強度均有顯著升高（P<0.05）。與SAP組相比，PNS組大鼠胰腺細胞內(nèi)Ca2的熒光強度均有顯著降低（P<0.05）。病理學評分：與s0組相比，PNS和SAP2組大鼠胰腺組織水平均顯著增高（P<0.05）。PNS組大鼠胰腺組織病理學評分顯著低于SAP組（P<0.05）。結(jié)論 SAP發(fā)生時，細胞鈣超載程度越高，SAP的病情越重。CAMKⅡ一γ的表達量與胰腺炎病情輕重有關(guān)，三七總皂苷（PNS）干預可抑制胰腺細胞內(nèi)CAMKⅡ-γ的表達，從而緩解胰腺細胞內(nèi)鈣超載，可以減輕胰腺組織病理學改變。

關(guān)鍵詞：三七總皂苷；急性重癥胰腺炎；鈣超載；鈣一鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ型

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1007 - 2349（ 2015） 02 - 0055 - 04急性重癥胰腺炎（ severe acute pancreatitis，SAP）屬于急性胰腺炎的特殊類型，其病情險惡、并發(fā)癥多、病死率較高一直是臨床上棘手的問題。其常在早期合并全身炎癥反應綜合征（ Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS）和多器官功能衰竭（ Multiple Organ Disfunction Syndrome，MODS），其病死率高達20%-30%。目前在SAP的診治方面雖然取得了不少進展，并發(fā)癥發(fā)生率有明顯下[1]，但其病死率卻居高不下，而且針對其發(fā)病機制的了解還不十分明確2。近年來針對胰腺細胞鈣超載的研究越來越受到關(guān)注。鈣一鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ一γ（CAMKⅡ-γ）是一類由Ca2+/CaM激活的多功能蛋白激酶，通過結(jié)合后發(fā)生自身磷酸化，進而發(fā)揮相應的生物學作用。三七總皂苷（ PNS）在治療胰腺炎方面有著較為長遠的歷史，目前在臨床中也廣為使用，其療效也受到廣泛認可本文通過建立大鼠急性重癥胰腺炎模型，并給予三七總皂苷進行干預，了解三七總皂苷對胰腺細胞鈣超載的調(diào)節(jié)及其作用機制。1 材料與方法1.1 建模及分組清潔級雄性SD大鼠15只（第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供）體重200～ 220 g，分成假手術(shù)組（n=5），急性重癥胰腺炎（ SAP）組（n=5），三七總皂甙預處理組（PNS組）組（n=5）。造模前禁食24h，自由飲水。SO組僅打開腹腔，翻動腸管。其余2組采用許永春等[3]使用的改良逆行膽胰管注射法逆行注射5%牛黃膽酸鈉溶液（Sigma公司），其中PNS組術(shù)前30 min腹腔注射三七總皂苷（血塞通注射液昆明興中制藥有限責任公司）。分別于術(shù)后24h分批處死大鼠，留取胰腺組織備用。1.2胰腺腺泡細胞內(nèi)鈣離子濃度的檢測 取胰腺組織后立即使用膠原酶獲得胰腺腺泡細胞懸液。取部分細胞懸液將Fluo -3 - AM（5 μmol/L。）試劑在37℃下避光孵育細胞30 min，后洗凈細胞外熒光。在熒光顯微鏡下觀察胰腺腺泡細胞內(nèi)鈣離子的顯影（圖1）。使用流式細胞儀（ FCM）中調(diào)整加載后的胰腺細胞懸液，使其細胞濃度為5×108個/L。洗凈細胞外熒光，應用FCM（激發(fā)波長488 nm）隨機測定單個胰腺細胞的熒光強度值，取1 x104個/L胰腺細胞內(nèi)鈣離子的熒光強度的平均值。1.3胰腺組織病理學評分經(jīng)腹腔獲取胰腺組織，取大小約0.5cm×0.5cm×0.5cm胰腺組織用10%甲醛溶液固定、石蠟包埋、4μm切片、HE染色后，光鏡下觀察胰腺組織的病理改變。按照采用改良Grewal等[4]的方法對SAP大鼠胰腺組織損傷進行定量評估。1.4實時定量熒光PCR測定CaMKⅡmRNA表達水平40～50 mg胰腺組織，采用TRIzol試劑冰上提取胰腺組織總RNA.逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，熒光標記物、探針及引物由廣州富能科技有限公司提供，內(nèi)參基因為CAPDH（產(chǎn)物為123bp）、目的基因為CaMKⅡ-γ（產(chǎn)物為96bp）。擴增體系反應條件：95℃ 10 min變性，95℃ 15S、600℃ 30S、72℃ 45S.這樣循環(huán)40次。在7500快速實時定量PCR系統(tǒng)中進行體系擴增和結(jié)果分析，得出每一樣品的循環(huán)熒光域值（Ct值）。反應完成后再于95℃ [5S、60℃l min、95℃15 S后繪制熔解曲線。使用Schmittgen和Livak設計的閾值法來測定目的基因的相對表達水平。目的基因量=2 -△△Ct，△△Ct=（Ct目的基因- Ct管家基因）實驗組一（Ct目的基岡- Ct管家基因）對照組。1.5統(tǒng)計學處理以SPSS1 1.7軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)土標準差表示，進行方差齊性檢驗，根據(jù)樣本的性質(zhì)采用單兇素方差分析、LSD -t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1胰腺細胞內(nèi)[Ca2+]i的熒光強度S0組、SAP組、PNS組3組之間胰腺細胞內(nèi)Ca2的熒光強度具有統(tǒng)計學差異。SAP組和PNS組2組大鼠胰腺細胞內(nèi)Ca2的熒光強度均有顯著升高（P<0.05）。PNS組大鼠胰腺細胞內(nèi)Ca2的熒光強度較SAP組有顯著降低（P<0.05），見表1、組圖2。2.2胰腺組織病理學評分SAP組、PNS組2組開腹后肉眼可見胰腺組織均出現(xiàn)了腫脹、滲出、點狀出血、局灶性壞死。SO組、PNS組和SAP組3組大鼠胰腺組織病理學評分具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。S0組大鼠胰腺組織病理學評分較SAP組及PNS組顯著降低（P<0.05），PNS組較SAP組顯著降低（P<0.05）見表1、組圖1。2.3胰腺腺組織CaMKII -γmRNA表達水平SAP組、PNS組和so組3組胰腺組織在96bp處均能見到有CAMKⅡ一γmRNA的PCR產(chǎn)物的條帶，其陽性內(nèi)參CAPDH mRNA的PCR產(chǎn)物也可以在123bp處可見。通過統(tǒng)計學分析可知，SAP組和PNS組2組CAMKⅡ-γmnRNA的表達水平顯著高于SO組（P<0.05），而PNS組的表達水平則低于SAP組（P<0.05）。見表l、組圖3。3討論

關(guān)于急性重癥胰腺炎的發(fā)病機制，同前的研究的學說眾多。其主要包括：胰酶消化學說、炎性因子過度激活學說、氧化應激學說、腸道細菌感染、微循環(huán)障礙、細胞調(diào)亡學說、基因多態(tài)性學等。近年來針對“鈣超載”學說的研究愈來受到關(guān)注。曾孝征和范維珂研究發(fā)現(xiàn)存胰管高壓、乙醇、病毒、缺氧以及高鈣血等情況下都會引起胰腺腺泡細胞內(nèi)游離Ca2+的濃度升高，從而誘發(fā)胰腺炎的發(fā)生[5-6]。臨床工作中發(fā)現(xiàn)高鈣血癥患者更容易發(fā)生急性胰腺炎，同時大量文獻也提示胰腺炎患者血鈣濃度會降低[7] 正常情況卜，胰腺腺泡細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)定在150mmol/L，水平左右，而胞內(nèi)游離Ca2+含量很少，但是游離Ca2是重要的第二信使，通過調(diào)控符種信號通路而影響細胞活動及功能。當腺泡細胞內(nèi)Ca2這種穩(wěn)態(tài)會火衡則會誘發(fā)胰腺炎。在動物胰腺炎模型中發(fā)現(xiàn)在胰腺炎早期胰腺組織內(nèi)Ca2+會異常積聚，并且積聚程度與胰腺炎發(fā)展成正相關(guān)。體外實驗中也發(fā)現(xiàn)腺泡胰晦活性有賴于外源性Ca2+的濃度，相反降低這些外源性Ca2+的濃度也可以減少胰酶的激活[8]

鈣一鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II（CaMKⅡ）足一類由Ca2+/CaM激活的多功能蛋白激酶，通過結(jié)合后發(fā)生自身磷酸化，參與細胞內(nèi)多種信號通路，完成各種生物功能。CaMKⅡ有α、β、γ、δ4種亞型，而α、β這兩種亞型重要在神經(jīng)細胞內(nèi)表達。而在胰腺組織中主要以γ型表達。純化的在鈣/鈣調(diào)素（ Ca-+/CaM）缺失時幾乎沒有生物活性，有研究發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ在與鈣/鈣調(diào)素結(jié)合后其活性最少增加200倍[9]。這種結(jié)合會引起分子構(gòu)象即改變，使分子中抑制結(jié)構(gòu)域發(fā)生自身磷酸化，并依次磷酸化細胞中的其它靶蛋白，從而表現(xiàn)出鈣/鈣調(diào)素依賴性的生物學活性。胰腺細胞內(nèi)Ca2進入細胞主要通過細胞內(nèi)外的鈣離子通道來實現(xiàn)，而CaMKⅡ則磷酸化細胞膜上的L型鈣通道以及相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白，是通道開放大量Ca2進入細胞[10]。同時還可以去除肌質(zhì)網(wǎng)上的抑制蛋白，導致肌質(zhì)網(wǎng)上鈣通道打開，大量Ca2進入細胞內(nèi)，引起細胞內(nèi)鈣超載。

目前三七總皂苷對于胰腺炎的治療已經(jīng)十分常見，也得到了臨床實踐的認可。張恒[11]：在對70例臨床胰腺炎患者治療觀察，通過統(tǒng)計患者血中C反應蛋白變化發(fā)現(xiàn)奧曲肽聯(lián)合三七總皂苷在急性胰腺炎的綜合治療中可發(fā)揮協(xié)同作用，療效優(yōu)于單用奧曲肽。在動物實驗中==七總皂苷在治療胰腺炎的機制方面在炎性因子、氧自由基方面報道較多[12]，但對于鈣超載報道較少。在對嚴重燒傷后機體免疫系統(tǒng)功能的研究發(fā)現(xiàn)中藥三七皂苷對肌醇脂質(zhì)信號系統(tǒng)巾IP3一CaM途徑具有較好的調(diào)理作用[13]。在對大鼠腦組織缺血再灌注研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可以減少大鼠海馬及皮層CaMKⅡ-βmRNA及蛋白表達[14]。在本實驗中，通過對大鼠胰腺炎治療24h各項檢測指標發(fā)現(xiàn)：使用三七總皂苷可以減少胰腺的病理損傷，對胰腺組織起到保護作用。運用流式細胞儀檢測細胞的熒光強度提示三七總皂苷對于胰腺腺泡細胞鈣超載有所緩解。在使用實時定量熒光PCR測定CaMKⅡmRNA表達水平表明，三七總皂苷可以降低由于胰腺炎而升高的組織內(nèi)CaMKⅡmRNA的表達水平。綜上所述，胰腺炎的發(fā)病機制中鈣超載起到十分關(guān)鍵的作用，三七總皂苷可以通過減少組織內(nèi)CaMKⅡmRNA的表達水平從而減低細胞內(nèi)Ca2的濃度。而對于CaMKⅡ的蛋白水平的影響和臨床中對患者體內(nèi)的變化，仍需要進一步研究。參考文獻[1]UhlW， ISENMAN N R，CURTI G， et al. Influence. of etiology on thecourse and outcome of acute pancreatitis. Pancreas， 1996，13（1）：335-343.[2] MCNAMARA D.Pancreatic diseases[J].Aliment Pharmacol Ther，2003 ，18（ Suppl）：60 - 65.[3]許永春，李兆申，屠振興，等.改良逆行膽胰管注射法制備輕重不同兩種大鼠急性胰腺炎模型.第二軍醫(yī)大學學報，2004 ，25（11）：1251-1252.[4] GREWAL HP， MOHEY EL DIN A， GABER L，et al.Amelioration ofthe physiologic and biochemical changes of acute pancreatitis using ananti - TNF - alpha polyclonal antibody[J].Am J Surg，1994：167（1）：214 - 218.[5]曾孝征.組織學與胚胎學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：219 – 222.[6]范維珂，胰腺的病理生理學[M].（下冊）.上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1984：419-425[7]李祖銘，急性胰腺炎患者血清白蛋白、葡萄糖、鈣水平的變化及臨床意義[J].內(nèi)科急危重癥雜志，16（3）：149-150.[8] CRIDDLE DN， CERASIMENKO JV， BAUMGARTNER HK， etal. Calcium signaling and pancreatic cell death：apoptosis or[J].CellDeath Differ 2007 ，14：1285 - 1294.[9] HOWARD S. Phosphorylation of microtubule - associated proteins hy acalcium/calmodulin - dependent protein kinase[J] J Cell Biol，1984，99（7）：11 -19.[10] CURRIE S.Cardiac ryanodine receptor phosphorylation by CaM Ki-nase U：keeping the ba lance right， Front Bioscl，2009 ，14（1）：5134-5156.[11]張恒，倪鴻昌.奧曲肽聯(lián)合三七總皂苷在急性胰腺炎綜合治療中的療效觀察[J].安徽醫(yī)藥，15（12）：1581 -1583.[12]葛忠，張東生，胡義利，等.三七皂苷和善寧對大鼠急性重癥胰腺炎治療作用的比較研究[J]，中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，14（12）：17 – 22.[13]羅中華，蔡紹麗，黃文華，等.三七皂苷對燙傷小鼠巨噬細胞IP3CaM信號途徑的影響[J].第三軍醫(yī)大學學報，2001 ，23（8）：925 - 927.[14]牛增強，閆玉仙，馬春玲，等三七總皂苷對嗎啡戒斷大鼠海馬組織aMKⅡ活性及CaMK Ⅱα亞基蛋白表達的影響[J].中國藥物依賴性雜志，2008 ，17（2）：102-105（收稿日期：2014-11-07）