⁶⁰Co—γ射線誘變紫花苜蓿WL525HQ的SSR研究

劉勝洪 周玲艷 楊妙賢 劉文 趙鋼

摘要：為了探究60Co-γ射線對(duì)紫花苜蓿誘變產(chǎn)生的微衛(wèi)星變異及其輻射敏感性，用2 000 Gy劑量的 60Co-γ 射線輻射處理紫花苜蓿WL525HQ的種子。紫花苜蓿WL525HQ在人工溫室栽培后，比較了輻照組和對(duì)照組之間各20個(gè)不同單株的簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）的多態(tài)性變化。結(jié)果表明：7對(duì)引物均可擴(kuò)增出紫花苜蓿WL525HQ的多態(tài)性位點(diǎn)，其中有5對(duì)引物的多態(tài)性位點(diǎn)百分比達(dá)到100%。經(jīng)過計(jì)算該品種的多態(tài)性位點(diǎn)百分率（percentage of polymorphic band，PPB）值和多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC）值發(fā)現(xiàn)，輻射組的PPB平均值達(dá)97.73%，略低于對(duì)照組的98.94%；而輻射組的PIC平均值為0.853 0，略高于對(duì)照組的0.849 2。說明 60Co-γ 射線使紫花苜蓿不同單株之間的SSR位點(diǎn)多態(tài)性產(chǎn)生了一定程度的變異，但也體現(xiàn)出WL525HQ品種對(duì)60Co-γ 射線具有較高的耐受力。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；輻射；SSR；多態(tài)性；WL525HQ

中圖分類號(hào)： S335.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0238-03

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）屬多年生優(yōu)良豆科牧草，是世界上種植最多、應(yīng)用較為廣泛、生產(chǎn)潛力大的重要牧草。由于紫花苜蓿具有適應(yīng)性強(qiáng)、品質(zhì)好、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)，素有“牧草之王”的美譽(yù)，在現(xiàn)代草業(yè)和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展中占有重要地位[1]。

研究表明，通過空間誘變、零磁空間誘變、輻射誘變均可引起苜蓿DNA水平上的變異[2-3]，其中，60Co-γ輻射誘變是苜蓿育種的重要手段之一。60Co-γ射線具有能量高、穿透力強(qiáng)的特點(diǎn)，可造成DNA分子堿基變化、脫氧核糖變化、單鏈斷裂、雙鏈斷裂以及DNA交聯(lián)等，致使染色體發(fā)生變異，從而對(duì)苜蓿的某些性狀進(jìn)行改良[4]。目前，苜蓿的誘變育種工作已經(jīng)在國內(nèi)外廣泛展開，苜蓿的輻射敏感性、育種的適宜劑量及其輻射誘變規(guī)律等工作成為各國學(xué)者普遍關(guān)注和研究的課題[5]。

與其他DNA分子標(biāo)記相比，簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記具有數(shù)量豐富、信息含量高、重復(fù)性好等特點(diǎn)，并且SSR標(biāo)記覆蓋整個(gè)基因組，呈現(xiàn)多基因特點(diǎn)，表現(xiàn)為共顯性遺傳[6-7]。因此本研究利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)可以在基因組范圍內(nèi)較廣泛地觀察紫花苜蓿的變異情況，對(duì)于苜蓿育種研究具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 輻照處理與種植

本試驗(yàn)所用的材料為WL525HQ紫花苜蓿，在華大生物科技有限公司輻照中心進(jìn)行60Co-γ輻射處理，輻射劑量為 2 000 Gy，對(duì)照組為未經(jīng)輻射處理。紫花苜蓿種子用0.1% HgCl2消毒5 min，然后用去離子水沖洗3次后播種于仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院鐘村教學(xué)農(nóng)場(chǎng)大棚內(nèi)。分別取20張輻照處理組、對(duì)照組植株的幼嫩葉片進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 DNA的提取及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

分別取輻照處理組、對(duì)照組苜蓿葉片0.1 g，放入研缽，加入約1 g石英砂、1.6 mL提取液[2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、15%聚乙烯吡咯烷酮-40、0.9% NaCl、 6.2% NaAc·3H2O、5% HAc]，提取方法采用十二烷基硫酸鈉法[8]，并通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

采用9對(duì)穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的 SSR 引物[9-11]（表1）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系為：0.5 μL DNA樣品（30 ng），2 μL 10×buffer，1.2 μL MgCl2（25 mmol/L），0.5 μL dNTPs（10 mmol/L），04 μL上游引物（10 μmol/L），0.4 μL下游引物（10 μmol/L），1 μL Taq 酶（0.5 U/μL），15.6 μL雙蒸水。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 50 s，55～57 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物采用含7 mol/L尿素的 6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

根據(jù)條帶的有無，在Excel表格上構(gòu)建0，1矩陣圖，多態(tài)性位點(diǎn)百分率（percentage of polymorphic band，PPB）按照以下公式計(jì)算：

多態(tài)性百分率=多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)量/總位點(diǎn)數(shù)量×100%。

等位位點(diǎn)頻率的計(jì)算方法參考等位基因的頻率計(jì)算方法[12]：等位位點(diǎn)頻率p=位點(diǎn)數(shù)量/總位點(diǎn)數(shù)量。計(jì)算出等位位點(diǎn)頻率后，用Picalc軟件計(jì)算位點(diǎn)的多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取

本研究采用高鹽低pH值的SDS核酸提取法[8]。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，點(diǎn)樣孔清晰無雜質(zhì)，基因組DNA條帶清晰完整（圖1）。紫外分光光度結(jié)果分析表明，樣品D320 nm值接近 0，D260 nm/D280 nm值在 1.85～1.98之間，說明提取的DNA 純度較高，符合 PCR擴(kuò)增的要求。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)

用7對(duì)SSR引物對(duì)紫花苜蓿處理組、對(duì)照組的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明， 7對(duì)引物的主要擴(kuò)增位點(diǎn)位于 100～200 bp之間，處理組和對(duì)照間的SSR位點(diǎn)發(fā)生了不同程度的變化，僅有少量片段未發(fā)生變化，如W6019引物擴(kuò)增的位點(diǎn)在110 bp 處變化不明顯（圖2中的D1、D2）。從圖2中的A1、A2、B1、B2來看，引物Afca1、Afca11在輻射處理后SSR擴(kuò)增帶數(shù)量未發(fā)生變化；從圖2中的D1、D2、F1、F2看，引物W6019、Alf2在輻射處理后SSR擴(kuò)增帶數(shù)量出現(xiàn)增加，條帶位置有所改變；其余的3對(duì)引物在輻射處理后SSR擴(kuò)增條帶數(shù)量均減少（圖2中的C1、C2、E1、E2、G1、G2）。

2.3 輻射處理苜蓿的多態(tài)性分析

通過PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)各個(gè)SSR位點(diǎn)的多態(tài)性，結(jié)果如表1所示。可見所使用的7對(duì)引物均可擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)，引物Afca1、Afca11在苜蓿輻射處理后的SSR擴(kuò)增總位點(diǎn)數(shù)未發(fā)生變化；引物W6019、Alf2在苜蓿輻射處理后SSR擴(kuò)增總位點(diǎn)數(shù)出現(xiàn)增加的現(xiàn)象，條帶位置有所改變；其余的3對(duì)引物在輻射處理后SSR擴(kuò)增總位點(diǎn)數(shù)均減少。7對(duì)引物中有5對(duì)引物的多態(tài)性位點(diǎn)百分率達(dá)到100%。經(jīng)過計(jì)算苜蓿的PPB值、PIC值后發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的PPB平均值略高于輻射處理組，而對(duì)照組的PIC平均值略低于輻射處理組。說明 2 000 Gy 劑量的60Co-γ輻射對(duì)紫花苜蓿WL525HQ品種有一定的誘變作用，同時(shí)紫花WL525HQ對(duì)60Co-γ射線具有較高的耐受力。

3 結(jié)論與討論

紫花苜蓿是多年生豆科植物，其葉、莖均含有較多的蛋白質(zhì)、酚類、單寧等次生代謝物。因此，在提取苜蓿基因組DNA的時(shí)候，應(yīng)該選取含有次生代謝產(chǎn)物較少的幼嫩葉片，比較有利于DNA的提取。高質(zhì)量DNA的提取是植物基因組研究的基礎(chǔ)[13]。本研究使用的高鹽低pH值的核酸提取方法能抑制或避免細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)與核酸發(fā)生反應(yīng)，有效去除核蛋白，抑制各種酶活性，適用多種植物中提取DNA和RNA[14]。本研究提取的DNA樣品中雖然存在少量RNA，但依然取得了較好的PCR擴(kuò)增效果。

苜蓿是異花授粉植物，品種內(nèi)個(gè)體間基因型雜合，在種子繁育時(shí)通常采用開放式授粉，品種內(nèi)個(gè)體間相互傳粉造成個(gè)體間基因型不同[9]，有學(xué)者利用PL34HQ（南澳品系） 品種自交系進(jìn)行SSR研究，發(fā)現(xiàn)苜蓿品種內(nèi)不同單株間存在多態(tài)性差異[15]。另外，各地農(nóng)業(yè)品種主管部門在苜蓿品種的選育過程中亦未將分子標(biāo)記作為選育依據(jù)。因此，本研究對(duì)照組的不同單株間存在多態(tài)性差異。

目前，植物誘變育種主要利用化學(xué)誘變、紫外線誘變、輻射誘變、太空誘變等手段，對(duì)植物的種子、枝條、愈傷組織（離體培養(yǎng)）等進(jìn)行誘變，均已證明可以引起植物微衛(wèi)星DNA發(fā)生變異[16]。利用誘發(fā)突變技術(shù)能夠誘發(fā)各種有用的基因突變，產(chǎn)生自然界稀有的或用常規(guī)方法較難獲得的新類型、新性狀、新基因。輻射誘變技術(shù)已成為我國科學(xué)工作者開創(chuàng)農(nóng)作物誘變遺傳改良的一種有效途徑[17]。

但是，不同作物或同種作物不同品種對(duì)誘變存在生理或遺傳的敏感差異。不同品種的一品紅的生理指標(biāo)因輻射敏感性不同而隨輻射呈現(xiàn)完全不同的變化趨勢(shì)[18]；葉開玉等對(duì)4個(gè)獼猴桃品種輻照后的嫁接成活率、植株生長量的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，隨輻射劑量的變化，獼猴桃的嫁接成活率及生長量在品種間差異較大[19]；章鐵等發(fā)現(xiàn)，蘭花在輻射后，突變體與對(duì)照品種之間有穩(wěn)定的分子多態(tài)性差異[20]；在對(duì)茄子[21]、甘藍(lán)型油菜[22]、大豆[23]、苜蓿[24]、茶樹[25]和芝麻[26]的誘變研究中發(fā)現(xiàn)，作物對(duì)誘變的敏感性可分為極敏感型、敏感型、中間型、遲鈍型4個(gè)類型[27]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿WL525HQ品種在60Co-γ射線照射后，其微衛(wèi)星位點(diǎn)發(fā)生了一定程度的變異，但其具有較高的60Co-γ射線耐受力，屬輻照遲鈍型[24，27]。因此，在實(shí)際輻照育種過程中可選擇適當(dāng)?shù)妮椪談┝浚蕴岣咦魑锲贩N的成活率和變異率。

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