乳酸菌對(duì)老面團(tuán)發(fā)酵過(guò)程中可溶性糖和游離氨基酸含量的影響

宋佳錕，張 灝，趙建新 （江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫 214000）

我國(guó)傳統(tǒng)主食饅頭香甜可口，有著獨(dú)特的風(fēng)味，這是由于其采用的老面是一種天然發(fā)酵劑，有著多菌種混合發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)［1］。老面中含有豐富的微生物，是一種復(fù)雜的生化體系，含有多種微生物的酸面團(tuán)在發(fā)酵過(guò)程中相互作用，它們產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物也相互作用，改變了面團(tuán)的生化特性甚至是物理性質(zhì)［2－5］。老面中的微生物主要為植物乳桿菌、舊金山乳桿菌、短乳桿菌、戊糖片球菌、短乳桿菌等乳酸菌和少量的酵母菌。乳酸菌在面團(tuán)中利用各種糖類進(jìn)行發(fā)酵，根據(jù)其發(fā)酵過(guò)程的不同可以分為同型發(fā)酵和異型發(fā)酵2種途徑，同型發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，而異型發(fā)酵除了乳酸外還生成乙醇、乙酸和二氧化碳等。小麥面粉中含有1．5%左右的可溶性碳水化合物，這取決于面粉和微生物的水解酶與微生物消耗之間的平衡［6］。Kim等研究發(fā)現(xiàn)，面團(tuán)發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生風(fēng)味成分如乳酸、乙醇、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物和羰基化合物等是由于面粉中的酶類被激活［7］。此外，還生成大量的醛類、酮類等化合物，這些化合物再相互作用產(chǎn)生多種維生素、氨基酸使得制品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到提升［8］，另外還會(huì)產(chǎn)生多種新的呈味物質(zhì)［9］。氨基酸和多肽可以被微生物用作重要前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為風(fēng)味物質(zhì)［10］。從這些研究成果中可以看出，乳酸菌對(duì)于老面中的糖代謝和氨基酸的產(chǎn)生有著很大的影響，但是現(xiàn)在還沒(méi)有關(guān)于不同的乳酸菌對(duì)于老面中可溶性糖和游離氨基酸含量的影響的研究報(bào)告。所以筆者的主要研究?jī)?nèi)容為不同的乳酸菌對(duì)于老面發(fā)酵過(guò)程中可溶性糖和游離氨基酸含量變化的影響。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 主要原輔料。風(fēng)箏牌高筋小麥粉;乳酸菌，實(shí)驗(yàn)室保藏;活性干酵母，安琪酵母股份有限公司;去離子水，飄之霖實(shí)驗(yàn)用水;定性濾紙。

1．1．2 主要試劑。D（－）果糖，葡萄糖，蔗糖，D（+）麥芽糖，乙腈（色譜純），三氯乙酸（分析純）。

1．1．3 培養(yǎng)基。MRS液體培養(yǎng)基配方:魚(yú)粉蛋白胨10．0 g、牛肉膏 10．0 g、酵母膏 5．0 g、葡萄糖 20．0 g、無(wú)水乙酸鈉 5．0 g、MgSO4·7H2O 0．1 g、MnSO4·H2O 0．05 g、檸檬酸二銨 2．0 g、磷酸二氫鉀 2．0 g、吐溫 80 1 ml、去離子水 1 000 ml。MRS固體培養(yǎng)基配方:在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加2%的瓊脂條。孟加拉紅固體培養(yǎng)基:蛋白胨5．0 g、葡萄糖10．0 g、磷酸二氫鉀1．0 g、硫酸鎂 0．5 g、瓊脂 20．0 g、孟加拉紅 0．033 g、氯霉素0．1 g。

1．1．4 主要儀器。不銹鋼蒸汽滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司;超凈工作臺(tái)SW－CJ－1FD，蘇州安泰空氣技術(shù)公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱PYX－DHS，上海一恒科技有限公司;冷凍離心機(jī)，Heal Force;超低溫冰箱 M DF－U53V，SANYO;氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀Trace MS型，美國(guó)Finnigan公司;分析天平AB104－N，METTLR。

1．2 方法

1．2．1 老面的制作方法。取冷藏保存的乳酸菌菌液200 μl接入10 ml液體MRS培養(yǎng)基活化2次。量取1 ml（菌體密度108/ml）處于對(duì)數(shù)期的乳酸菌菌液，于5 000 r/min離心15 min。取菌泥和1 g酵母粉加入100 g水混勻，活化5 min后加入100 g面粉攪拌均勻。

1．2．2 老面發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌和酵母菌活菌數(shù)的測(cè)定。取10 g老面加入90 ml無(wú)菌生理鹽水，置于磁力攪拌器上攪拌20 min混勻，稀釋至適當(dāng)?shù)奶荻戎?，涂布于固體培養(yǎng)基上一定時(shí)間后計(jì)數(shù)，通過(guò)形成的菌落數(shù)計(jì)算出老面中的活菌密度。乳酸菌的計(jì)數(shù)采用MRS固體培養(yǎng)基，接種后平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。酵母菌計(jì)數(shù)采用孟加拉紅固體培養(yǎng)基，接種后置于30℃倒置恒溫培養(yǎng)48 h。

1．2．3 可溶性糖含量的測(cè)定方法。

1．2．3．1 色譜條件。色譜柱:Prevail Carbohydrate ES Columns（250 mm ×4．6 mm，5 μm）;流動(dòng)相:乙腈 － 水（體積比70∶30），使用前先經(jīng)過(guò) 0．45 μm 濾膜過(guò)濾;流速:1．0 ml/min;柱溫:25℃;ELSD參數(shù):漂移管溫度83．5℃，載氣流速2．2 L/min;進(jìn)樣量:10 μl。

1．2．3．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作［11］。準(zhǔn)確稱?。ň_至 0．000 1 g）干燥至質(zhì)量恒定的麥芽糖0．2 g，果糖、葡萄糖、蔗糖各0．05 g，分別用純凈水定容于50 ml容量瓶中。用自動(dòng)進(jìn)樣器分別注入1、3、5、7、10 μl 4 種糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線，計(jì)算線性回歸方程。同時(shí)配制果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，使各糖的質(zhì)量濃度均約為1 mg/ml，進(jìn)樣量10 μl作為標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖。表1為標(biāo)準(zhǔn)回歸方程。

表1 標(biāo)準(zhǔn)回歸方程

1．2．3．3 樣品測(cè)定［11］。準(zhǔn)確稱取樣品 25 g（精確至 0．000 1 g），置于100 ml容量瓶中，加水約50 ml，超聲提取20 min，慢慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%三氯乙酸溶液5 ml，用蒸餾水定容至刻度、混勻，靜置30 min，用干燥濾紙過(guò)濾，棄去初濾液數(shù)毫升，濾液離心（8 000 r/min，20 min，4 ℃），經(jīng) 0．22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，待上機(jī)。

制備好的樣液10 μl注入高效液相色譜，在“1．2．3．1”測(cè)定條件下記錄果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖的峰面積，依據(jù)保留時(shí)間分別用外標(biāo)法計(jì)算各組分的質(zhì)量濃度，再計(jì)算樣品中各組分的含量。

1．2．4 游離氨基酸含量的測(cè)定方法。采用HPLC法，取1．000 0 g老面加入15 ml錐形瓶中，加入約5 ml 5%三氯乙酸并攪拌均勻，倒入25 ml容量瓶中，用約5 ml 5%三氯乙酸沖洗15 ml錐形瓶?jī)?nèi)部后倒入25 ml容量瓶中，重復(fù)一次，再將25 ml容量瓶用5%三氯乙酸定容至25 ml。靜置2 h，上清液用雙層濾紙過(guò)濾，取3～5 ml濾液，10 000 r/min 5℃離心15 min。然后用鄰苯二醛進(jìn)行柱前衍生，然后使用HPLC進(jìn)行游離氨基酸分析。

色譜條件:ODS Hypersil毛細(xì)管色譜柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm），流動(dòng)相為20 mmol/L乙酸鈉的甲醇－乙腈溶液（體積比為1∶2），流速 1．0 ml/min，柱溫 40 ℃，338 nm 紫外檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2．1 老面發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌和酵母菌數(shù)量的變化 將從老面中分離出的明登乳桿菌Z4、植物乳桿菌S1、戊糖片球菌S2、舊金山乳桿菌S8和短乳桿菌S9分別按照“1．2．1”的方法制作其與酵母菌共同發(fā)酵的老面團(tuán)，對(duì)照組為不添加乳酸菌而只添加酵母菌的老面。按照“1．2．2”的方法測(cè)定6種老面在發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌和酵母菌活菌數(shù)的變化情況。由圖1可知，對(duì)照組中乳酸菌起始菌落數(shù)只有不到103，其他5種添加了乳酸菌的老面起始菌落數(shù)相同，均為107，發(fā)酵前6 h乳酸菌的數(shù)量增加緩慢，隨后開(kāi)始迅速增加，直到16 h之后增長(zhǎng)速率開(kāi)始放緩。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，明登乳桿菌的生長(zhǎng)速度明顯快于其他乳酸菌，并且在發(fā)酵時(shí)間達(dá)到20 h之后數(shù)量還在繼續(xù)增加;植物乳桿菌、舊金山乳桿菌和短乳桿菌在前16 h的生長(zhǎng)速度無(wú)明顯差異，16 h之后植物乳桿菌繼續(xù)快速生長(zhǎng)，而舊金山乳桿菌和短乳桿菌的數(shù)量增長(zhǎng)緩慢;戊糖片球菌在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)速度最慢，但是在20 h之后戊糖片球菌的數(shù)量已經(jīng)和舊金山乳桿菌、短乳桿菌沒(méi)有明顯差異。

圖2所示為酵母菌在添加6種老面中生長(zhǎng)變化情況，添加了乳酸菌能夠促進(jìn)老面中酵母菌的生長(zhǎng)，發(fā)酵起始階段0～3 h的時(shí)候幾種老面中酵母菌的數(shù)量沒(méi)有明顯差別，3 h后酵母菌的數(shù)量變化則不相同。明登乳桿菌對(duì)于酵母菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用最為明顯，其次為植物乳桿菌，再次為舊金山乳桿菌和短乳桿菌，最次為戊糖片球菌，酵母菌數(shù)量的增加使得面團(tuán)產(chǎn)期增加進(jìn)而導(dǎo)致了饅頭的比容及質(zhì)構(gòu)的變化。但是當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到15 h之后時(shí)，幾種老面中的酵母菌數(shù)量開(kāi)始趨近于一致，這是由于一方面老面中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗導(dǎo)致酵母菌無(wú)法繼續(xù)大量增殖;另一方面，乳酸菌在后期數(shù)量的增加多于酵母菌使得更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被乳酸菌利用。Hansen等證實(shí)了相對(duì)于異型發(fā)酵乳酸菌，酵母菌更加適應(yīng)和同型發(fā)酵乳酸菌進(jìn)行共同發(fā)酵［12］，明登乳桿菌為同型發(fā)酵乳酸菌，植物乳桿菌為兼性異型發(fā)酵乳酸菌，舊金山乳桿菌和短乳桿菌為異型發(fā)酵乳酸菌，這4種乳酸菌的生長(zhǎng)速度以及其對(duì)于酵母菌生長(zhǎng)速度的促進(jìn)作用的不同再次證明了Hansen等的研究成果。例外的是戊糖片球菌雖然是同型發(fā)酵乳酸菌，但是它和酵母菌的協(xié)同發(fā)酵作用卻是最弱的，這是因?yàn)槲焯瞧蚓纳L(zhǎng)速率相對(duì)于乳酸桿菌較慢導(dǎo)致的。

2．2 不同乳酸菌發(fā)酵老面過(guò)程中可溶性糖含量的變化 將明登乳桿菌Z4、植物乳桿菌S1、戊糖片球菌S2、舊金山乳桿菌S8和短乳桿菌S9按照“1．2．1”的方法制作其與酵母菌共同發(fā)酵的老面團(tuán)，對(duì)照組為不添加乳酸菌而只添加酵母菌的老面。按照“1．2．3”的方法測(cè)定6種老面在發(fā)酵過(guò)程中可溶性糖含量的變化情況。發(fā)酵過(guò)程中各糖濃度變化見(jiàn)圖3。如圖3（a）所示，前4 h主要由于酵母菌的快速生長(zhǎng)，6種老面中麥芽糖濃度都快速消耗，隨后各樣品中麥芽糖的變化趨勢(shì)不同。僅接種酵母菌的老面，16 h后麥芽糖的濃度維持在較低水平;對(duì)接種了乳酸菌的老面，4～8 h麥芽糖濃度快速降低，到12 h時(shí)麥芽糖濃度降低到了最低水平，這是由于酵母菌和乳酸菌的協(xié)同發(fā)酵，使得酵母菌的生長(zhǎng)速率加快，同時(shí)乳酸菌也在消耗面團(tuán)中的麥芽糖。其中添加了明登乳桿菌和舊金山乳桿菌的老面中麥芽糖的濃度降低到了接近0的水平，明登乳桿菌和酵母菌有很好的協(xié)同發(fā)酵作用，菌的快速生長(zhǎng)對(duì)于老面中的麥芽糖消耗非?？?，舊金山乳桿菌與酵母菌的協(xié)同作用雖然弱于明登乳桿菌，但是它能夠產(chǎn)生麥芽糖磷酸化酶促進(jìn)麥芽糖分解為葡萄糖［13］，使得老面中的麥芽糖含量較低。但是不同的乳酸菌對(duì)于老面中酵母菌的代謝促進(jìn)作用不一樣，使得它們的老面中麥芽糖的消耗速度存在差異。12 h之后，接種了乳酸菌的老面中麥芽糖的含量開(kāi)始逐漸增加，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵使得淀粉水解形成糊精、多肽等易溶于水的小分子量物質(zhì)使得酶能夠更加充分地利用原料生成麥芽糖。從圖3（a）中可以看到，接種明登乳桿菌和植物乳桿菌的老面在發(fā)酵末期麥芽糖含量有所升高，這為這2種乳酸菌提供了充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使得它們?cè)诎l(fā)酵末期還能夠繼續(xù)生長(zhǎng)。

如圖3（b）所示，6種老面在發(fā)酵過(guò)程中蔗糖含量均逐漸減少，接種單一酵母菌的老面，蔗糖的濃度在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中菌高于其他老面;接種酵母菌和乳酸菌的樣品蔗糖的濃度降低也較快，約9 h被消耗殆盡。由此看出，乳酸菌影響酵母菌對(duì)蔗糖的代謝。接種乳酸菌的老面蔗糖的濃度較低，總體來(lái)看呈下降趨勢(shì)，可能由于多種原因所致。

由圖3（c）可知，除了添加舊金山乳桿菌的老面，其他樣品的葡萄糖變化情況與麥芽糖的變化趨勢(shì)基本相同。舊金山乳桿菌產(chǎn)生麥芽糖磷酸化酶能夠?qū)Ⅺ溠刻欠纸鉃槠咸烟?，這使得老面中麥芽糖的含量降低而葡萄糖的含量增加。接種不同菌種發(fā)酵老面團(tuán)過(guò)程中，葡萄糖和麥芽糖濃度變化不同，這與菌種的代謝密切相關(guān)。

果糖以果葡聚糖形式存在面粉中，在所有谷物中的含量約為1% ～4%，能夠水解果聚糖β－果糖苷連接鍵的酵母酶（轉(zhuǎn)化酶和菊糖酶），受pH影響，在老面團(tuán)中活性可能被增強(qiáng)。如圖3（d）所示，接種單一酵母菌的樣品，前幾個(gè)小時(shí)果糖的濃度有所增加，但隨后濃度不再明顯變化，約16 h已低于其他樣品;接種植物乳桿菌Z4的樣品，果糖濃度的變化波動(dòng)較大，前12 h增加隨后的8 h內(nèi)降低;另外2種老面在發(fā)酵過(guò)程中果糖濃度都在緩慢增加。

2．3 不同乳酸菌發(fā)酵老面過(guò)程中游離氨基酸含量的變化 游離氨基酸是饅頭風(fēng)味物質(zhì)的重要前提物質(zhì)，將明登乳桿菌Z4、植物乳桿菌S1、戊糖片球菌S2、舊金山乳桿菌S8和短乳桿菌S9按照“1．2．1”的方法制作其與酵母菌共同發(fā)酵的老面團(tuán)，對(duì)照組為不添加乳酸菌而只添加酵母菌的老面。應(yīng)用“1．2．4”的方法測(cè)定老面發(fā)酵過(guò)程中FAA含量，結(jié)果如圖4所示。沒(méi)有添加乳酸菌的老面在發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸的含量持續(xù)下降，而添加了乳酸菌的老面在發(fā)酵初期FAA含量也是持續(xù)下降的，但是在8 h之后添加了明登乳桿菌、植物乳桿菌、舊金山乳桿菌和短乳桿菌的老面中FAA含量開(kāi)始逐漸增加，12 h之后添加了戊糖片球菌的老面中FAA也開(kāi)始迅速增加。老面發(fā)酵的酸化過(guò)程為面粉中的蛋白酶發(fā)揮最大活力提供了適宜條件，從而強(qiáng)化了蛋白降解。發(fā)酵初期乳酸菌的數(shù)量較少，面團(tuán)的酸化程度較低，沒(méi)有充分發(fā)揮面粉中蛋白酶的作用，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸菌的增加使得pH下降，進(jìn)而促進(jìn)蛋白酶水解蛋白質(zhì)使得FAA升高。戊糖片球菌產(chǎn)酸能力相對(duì)較弱使得老面中FAA的含量相對(duì)植物乳桿菌相對(duì)較少。添加舊金山乳桿菌和短乳桿菌的老面中FAA含量相對(duì)較高，這預(yù)示著這2種乳酸菌對(duì)于饅頭的風(fēng)味很可能有著更加積極的作用。另外有研究者發(fā)現(xiàn)，戊糖片球菌的蛋白酶活性較弱［14］，這可能也是其老面中FAA含量較低的一個(gè)原因。

3 結(jié)論

不同的乳酸菌與老面中的酵母菌的協(xié)同發(fā)酵作用強(qiáng)弱不同，其中同型發(fā)酵的明登乳桿菌效果最好，兼性異型發(fā)酵的植物乳桿菌次之，異型發(fā)酵的舊金山乳桿菌和短乳桿菌較弱，戊糖片球菌雖然是同型發(fā)酵，但是其生長(zhǎng)緩慢導(dǎo)致協(xié)同發(fā)酵作用不明顯;乳酸菌在發(fā)酵初期會(huì)使得老面中的可溶性糖含量減少加快，發(fā)酵后期不添加乳酸菌的老面中的可溶性糖含量較低，但是乳酸菌會(huì)使得發(fā)酵后期可溶性糖含量增加，同時(shí)乳酸菌會(huì)增加發(fā)酵期間老面中游離氨基酸的含量;其中明登乳桿菌Z4對(duì)于可溶性糖的代謝促進(jìn)最為明顯，戊糖片球菌S2的作為最弱，舊金山乳桿菌S8可以促進(jìn)麥芽糖的減少?gòu)亩黾悠咸烟堑暮?舊金山乳桿菌和短乳桿菌則對(duì)于游離氨基酸含量增加的促進(jìn)較為明顯。不同的乳酸菌對(duì)于老面中可溶性糖和游離氨基酸的代謝不同，這些變化會(huì)導(dǎo)致饅頭的質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味從而影響?zhàn)z頭的品質(zhì)。

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