壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對(duì)裸鼠乳腺癌移植瘤模型整合素αvβ3表達(dá)的影響

曹建雄，馮志威，何迎春，畢四麗，王文美，何丹，柳景紅（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙40007；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙4008；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，湖南長(zhǎng)沙40007）

壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對(duì)裸鼠乳腺癌移植瘤模型整合素αvβ3表達(dá)的影響

曹建雄1，馮志威2，何迎春2，畢四麗2，王文美2，何丹2，柳景紅3*
（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長(zhǎng)沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，湖南長(zhǎng)沙410007）

目的研究壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對(duì)裸鼠乳腺癌骨轉(zhuǎn)移整合素αvβ3表達(dá)的影響。方法將32只裸鼠接種乳腺癌細(xì)胞后，再隨機(jī)分為壯骨鎮(zhèn)痛膠囊預(yù)防組（下稱預(yù)防組）、壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組（下稱治療組）、氯磷酸二鈉膠囊對(duì)照組（下稱對(duì)照組）和模型組，每組各8只，分別予以上述相應(yīng)藥物干預(yù)，測(cè)定各組的抑瘤率，將移植瘤分離后進(jìn)行切片，HE染色，并用光鏡觀察其病理形態(tài)，采用免疫組化方法檢測(cè)移植瘤組織細(xì)胞黏附遷移相關(guān)的整合素αvβ3表達(dá)。結(jié)果預(yù)防組抑瘤率最高，與其他各組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組和對(duì)照組抑瘤率相當(dāng)，兩者比較（P＞0.05）。與模型組比較，各組整合素αvβ3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組與對(duì)照組比較（P＞0.05），而預(yù)防組αvβ3表達(dá)顯著低于治療組及對(duì)照組（P＜0.05）。結(jié)論壯骨鎮(zhèn)痛膠囊能抑制裸鼠乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能與移植瘤組織整合素αvβ3表達(dá)有關(guān)，預(yù)防組的效應(yīng)比治療組效應(yīng)強(qiáng)。

裸鼠乳腺癌；骨轉(zhuǎn)移；壯骨鎮(zhèn)痛膠囊；整合素αvβ3；裸鼠

〔Abstract〕Objective To study the effect of Zhuanggu Zhentong capsule on the expression of integrin-αVβ3 in nude mice with breast cancer metastatic tumor bone metastasis.Methods 32 nude mice inoculated with breast cancer cells were randomly divided into the prevention group of Zhentong Zhuanggu capsule（prevention group），the treatment of Zhentong Zhuanggucapsule（treatmentgroup），thecontrolgroupofClodronatecapsule（controlgroup）andthemodelgroup. Each group had eight nude mice and was with the drug intervention.The inhibition rate of tumor was determined，the metastatic tumor was spilt，and the pathological feature was observed by light microscope after HE staining.The expressionsofintegrin-αVβ3inadhesionmigrationrelativelyofmetastatictumortissuecellsweredetectedby immunohistochemical method.Result Compared with other groups，the inhibition rate of tumor in prevention group was the highest，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The inhibition rate of tumor of in treatment group and control group was almost at the same（P＞0.05）.Compared with the model group，the differences of integrin-αVβ3 expression in the other groups had statistically significant（P＜0.05）；the treatment group was compared with the control group（P＞0.05），while the αVβ3 expression in the prevention group was lower than that in prevention group and control group（P＜0.05）. ConclusionZhuangguZhentongcapsulecouldrestrainthegrowthofnudemousebreastcancermetastatictumor. The mechanism of action might be related to the expression of integrin-αVβ3 of metastatic tumor tissue，the effect ofprevention group was better than the treatment group.

〔Keywords〕naked mouse breast cancer；bone metastasis；Zhuanggu Zhentong capsule；integrin-αVβ3；nude mouse

乳腺癌最常見(jiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位之一是骨骼，約占晚期乳腺癌患者的70%［1］，骨轉(zhuǎn)移臨床表現(xiàn)中最主要的特點(diǎn)是出現(xiàn)頑固性疼痛，并出現(xiàn)進(jìn)行性加重，同時(shí)伴隨系列并發(fā)癥，比如骨質(zhì)疏松、病理性骨折等。整合素家族是一類異二聚體跨膜糖蛋白，這種糖蛋白是由一個(gè)α亞單位和一個(gè)β亞單位組成的，這兩種亞單位按照不同的組合構(gòu)成20余種整合素。它主要介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)之間的相互黏附和信號(hào)傳導(dǎo)，在體內(nèi)廣泛表達(dá)。其中，整合素αvβ3參與許多類型腫瘤的血管生成、侵襲、轉(zhuǎn)移，對(duì)于引起乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移起到極為重要的作用。前期研究表明，壯骨鎮(zhèn)痛膠囊的功效包括控制或縮小骨轉(zhuǎn)移病灶，減少骨相關(guān)事件。本實(shí)驗(yàn)旨在從分子水平研究經(jīng)壯骨鎮(zhèn)痛膠囊干預(yù)后，裸鼠乳腺癌移植瘤模型中整合素αvβ3表達(dá)活性的變化，探討壯骨鎮(zhèn)痛膠囊防治乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物BALB/c裸小鼠，體質(zhì)量（18±3）g，SPF級(jí)，雌性，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格許可證號(hào)：SCXK（湘）2009-0004，SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。高溫高壓消毒飼料及墊料，自由喂養(yǎng)，塑料瓶自由飲用消毒的自來(lái)水。飼料及實(shí)驗(yàn)室均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2細(xì)胞株人類乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，購(gòu)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞庫(kù)。

1.1.3藥物制備（1）壯骨鎮(zhèn)痛膠囊由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科制備，藥物組成：淫羊藿、補(bǔ)骨脂、骨碎補(bǔ)、桑寄生、穿山甲、黃芪、黨參、三七、雞血藤、延胡索、威靈仙、制南星、制地龍、全蝎、蜈蚣、陳皮、甘草，生產(chǎn)批號(hào)20101018，規(guī)格：0.45 g× 24粒/瓶。取壯骨鎮(zhèn)痛膠囊0.45 g，先將膠囊去殼，內(nèi)容物用10 mL無(wú)菌生理鹽水溶散搖勻，制成0.045 g/mL藥液，4℃保存。（2）氯磷酸二鈉膠囊藥液的制備拜耳醫(yī)藥保健有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字J20120040，規(guī)格400 mg×60粒/盒。將抗骨轉(zhuǎn)移藥物氯磷酸二鈉膠囊0.8 g溶于10 mL生理鹽水中，制成0.08 g/mL備用，4℃保存。

1.1.4試劑RPMI-1640培養(yǎng)基由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司生產(chǎn)；胰蛋白酶粉由北京中杉生物技術(shù)公司生產(chǎn)；新生小牛血清由杭州四季青公司提供；二甲基亞砜（DMSO）由北京鼎國(guó)公司提供；青霉素、鏈霉素由大連美羅制藥廠生產(chǎn)；H2O2內(nèi)源性酶滅活劑由武漢博士德公司提供；即用型SABC免疫組化試劑盒（產(chǎn)品貨號(hào)：SA1050）、兔抗鼠ITG泰斯特公司生產(chǎn)。

1.1.5主要儀器AE31型倒置顯微鏡及Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)均由Motic公司生產(chǎn)；GB204型電子天平由瑞士梅特勒公司生產(chǎn)；80-2型離心機(jī)由上海手術(shù)器械廠生產(chǎn)。

1.2方法

1.2.1造模與分組MDA-MB-231是一種人乳腺癌細(xì)胞株，將其培養(yǎng)于含15%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，并進(jìn)行細(xì)胞傳代。等到乳腺癌細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶，先使用D-Hank’s液洗滌之后，再以0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液將其消化，從中取出少許RPMI-1640培養(yǎng)液，并將其吹打成細(xì)胞懸液，同時(shí)將乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231細(xì)胞制成細(xì)胞懸液于裸小鼠前腋皮下接種，根據(jù)文獻(xiàn)方法［2-3］（裸鼠左心室注射MDA-MB-231BO細(xì)胞法造模），建立了人乳腺癌皮下移植瘤模型。再將32只裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，分別是：模型組、壯骨鎮(zhèn)痛膠囊預(yù)防組（下稱預(yù)防組）、壯骨鎮(zhèn)痛膠囊治療組（下稱治療組）以及氯磷酸二鈉膠囊對(duì)照組（下稱對(duì)照組）。

1.2.2給藥方法各組動(dòng)物都在SPF級(jí)動(dòng)物房中自由飲水、攝食，保持自然光照預(yù)適應(yīng)1周，并接種乳腺癌細(xì)胞懸濁液。預(yù)防組在接種乳腺癌細(xì)胞后次日開(kāi)始應(yīng)用壯骨鎮(zhèn)痛膠囊濃縮液灌胃，其他各組待裸鼠乳腺癌移植瘤體積達(dá)到約5 mm3時(shí)（見(jiàn)1.3.1）計(jì)算移植瘤體積，以0.2 mL蒸餾水給模型組的鼠灌胃；裸鼠灌藥量按照人的等效劑量進(jìn)行換算，即：小鼠灌胃劑量（g/kg）=等效系數(shù)×成人劑量（g）/成人體質(zhì)量（60 kg）。預(yù)防組、治療組以壯骨鎮(zhèn)痛膠囊濃縮液0.5 g/（kg·d）灌胃；對(duì)照組以氯磷酸二鈉膠囊濃縮液0.2 g/（kg·d）灌胃；3組灌胃頻率均為每日2次，持續(xù)30 d后，采用斷頸法處死各組動(dòng)物，分離移植瘤，并分別切取標(biāo)本制片。

1.3指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1移植瘤體積測(cè)定V=a×b2π/6（V為腫瘤體積，a為腫瘤長(zhǎng)徑，b為腫瘤短徑）。各組在接種乳腺癌細(xì)胞后次日開(kāi)始檢查，每隔一天測(cè)定一次移植瘤體積。

1.3.2抑瘤率計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，完整剝?nèi)∫浦擦鼋M織，電子天平準(zhǔn)確測(cè)量瘤體組織質(zhì)量，按照公式計(jì)算，抑瘤率=（模型組平均瘤體質(zhì)量-治療組平均瘤體質(zhì)量）/模型組平均瘤體質(zhì)量×100%。

1.3.3移植瘤組織HE染色及病理形態(tài)學(xué)觀察將移植瘤標(biāo)本分離后，從中切取小部分，并將其固定于中性甲醛。之后取出組織塊，通過(guò)常規(guī)水洗、脫水、透明、浸蠟4個(gè)過(guò)程后以石蠟包埋，將蠟塊放置于切片機(jī)中，5 μm連續(xù)切片并展開(kāi)，撈片貼附于載玻片上，以室溫保存，HE染色，光鏡觀察。

1.3.4整合素αvβ3的檢測(cè)將移植瘤標(biāo)本分離后，切取小部分標(biāo)本以多聚甲醛固定，經(jīng)過(guò)梯度乙醇逐級(jí)脫水，透明，石蠟包埋，切片，切片厚度大約為5 μm，酒精脫蠟，PBS沖洗3次；3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min，PBS沖洗3次，滴加5%BSA封閉液1 -2滴，蓋滿組織片，室溫孵育20 min，甩去多余液體，不洗；取配好的一抗工作液50～100 μL覆蓋組織，4℃過(guò)夜；取過(guò)夜片，PBS沖洗3次；滴加生物素標(biāo)記二抗，室溫孵育15 min；再以PBS沖洗3次；滴加試劑SABC 1～2滴，室溫孵育20 min；以PBS沖洗4次；拭去組織周圍多余殘留液，加50～100 μL DAB顯色液蓋滿組織片，孵育20 min；至PBS工作液中沖洗3次；以蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。按試劑盒要求操作。采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析并測(cè)定陽(yáng)性產(chǎn)物的光密度值作為αvβ3表達(dá)活性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1各組裸鼠瘤體質(zhì)量及抑瘤率變化比較

與模型組比較，預(yù)防組、治療組、對(duì)照組瘤體質(zhì)量均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。預(yù)防組瘤體質(zhì)量低于治療組和對(duì)照組（P＜0.05），抑瘤率高于另兩組（P＜0.05）。對(duì)照組與治療組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.2各組移植瘤病理形態(tài)學(xué)比較

模型組的細(xì)胞排列密集甚至重疊。細(xì)胞之間界限不清，細(xì)胞質(zhì)少，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形的泡狀，大核仁位于中央部位；治療組細(xì)胞則呈固縮狀態(tài)，細(xì)胞核通常染色質(zhì)增多，核呈多形性，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)角化，偶見(jiàn)角化珠形成；對(duì)照組細(xì)胞呈固縮狀態(tài)，有細(xì)胞間橋和/或角化物，具有典型的不規(guī)則巢狀，細(xì)胞多形性及復(fù)層排列；預(yù)防組細(xì)胞固縮，密度增加，輪廓變形，與周圍細(xì)胞分離染色質(zhì)變致密，著邊。見(jiàn)圖1（封三彩圖）。

2.3各組移植瘤組織整合素αvβ3表達(dá)的比較

與模型組比較，各組αvβ3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；治療組與對(duì)照組比較（P＞0.05），而預(yù)防組αvβ3表達(dá)顯著低于治療組及對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表2及圖2（封三彩圖）。

表1　各組藥物對(duì)裸鼠乳腺癌移植瘤的抑瘤作用比較（±s，n=8）

表1　各組藥物對(duì)裸鼠乳腺癌移植瘤的抑瘤作用比較（±s，n=8）

注：與模型組比較△P＜0.05；與預(yù)防組比較▲P＜0.05。下表同。

組別模型組預(yù)防組治療組對(duì)照組瘤體質(zhì)量（g）0.898±0.046 0.387±0.046△0.570±0.044△▲0.583±0.032△▲抑瘤率（%）—56.84 36.49▲35.45▲

表2　各組裸鼠移植瘤整合素αvβ3表達(dá)的比較（±s，%）

表2　各組裸鼠移植瘤整合素αvβ3表達(dá)的比較（±s，%）

組別模型組預(yù)防組治療組對(duì)照組n8888 αvβ3 28.65±5.21 10.25±3.37△15.15±2.03△▲15.90±4.56△▲

3　討論

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移（骨瘤）的病因病機(jī)有兩方面：一方面為久病或久用行氣活血、祛痰化毒之品，使腎虛不能生髓養(yǎng)骨，不榮則痛；另一方面為乳巖之毒乘虛深陷經(jīng)髓骨骼，氣血痰濁瘀毒閉阻經(jīng)絡(luò)，致不通則痛。壯骨鎮(zhèn)痛膠囊以中醫(yī)學(xué)“腎主骨生髓”的理論為指導(dǎo)，骨碎補(bǔ)為君藥，補(bǔ)腎強(qiáng)筋壯骨，活血散瘀止痛，標(biāo)本兼顧；仙靈脾、補(bǔ)骨脂、桑寄生助君藥補(bǔ)腎生髓，三七粉、莪術(shù)、延胡索、威靈仙、穿山甲散結(jié)通絡(luò)、消腫定痛，為臣藥；以生黃芪補(bǔ)虛托毒，使攻不傷正；再以制南星化痰散結(jié)，陳皮理氣健脾和中，酒白芍柔肝緩急止痛，皆為佐藥；頑痹邪氣久羈，又以制地龍、全蝎、蜈蚣攻毒散結(jié)、搜剔止痛；地龍之寒能制約諸藥之溫燥太過(guò)，并能引藥力達(dá)病所，甘草補(bǔ)脾益氣，調(diào)和諸藥亦具佐使之用。諸藥合用，使腎虛得補(bǔ)，筋骨得榮、痰氣瘀毒結(jié)聚得化、血活絡(luò)通、疼痛得止。

整合素αvβ3能夠通過(guò)特有的途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生物學(xué)功能。整合素αvβ3具有參與細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)一系列結(jié)合反應(yīng)的作用。在原發(fā)乳腺癌細(xì)胞、侵襲性乳腺癌細(xì)胞以及骨轉(zhuǎn)移灶的腫瘤細(xì)胞中整合素αvβ3的表達(dá)均呈陽(yáng)性［4］。整合素αvβ3在破骨細(xì)胞中也大量表達(dá)，同時(shí)在破骨細(xì)胞介導(dǎo)的溶骨性骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。整合素αvβ3能與骨組織中的骨橋蛋白和骨唾液蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，介導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞與骨小梁發(fā)生黏附［5］，從而導(dǎo)致乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生。

通過(guò)本項(xiàng)研究得出，預(yù)防組裸鼠平均瘤體質(zhì)量明顯低于另外3組裸鼠，抑瘤率也高于另外2組裸鼠。病理形態(tài)觀察上，治療組細(xì)胞呈固縮，細(xì)胞有角化的趨勢(shì)。預(yù)防組細(xì)胞固縮，密度增加，輪廓變形。結(jié)果表明，壯骨鎮(zhèn)痛膠囊具有明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)并減小瘤體的作用。

既往研究證實(shí)［6-9］，壯骨鎮(zhèn)痛膠囊能壯骨鎮(zhèn)痛、控制或縮小骨轉(zhuǎn)移病灶，減少骨相關(guān)事件，同時(shí)已從體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)壯骨鎮(zhèn)痛膠囊能顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移、黏附、增殖等。而乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的關(guān)鍵因素是腫瘤細(xì)胞和骨基質(zhì)的黏附，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的基本因素是骨唾液蛋白的浸潤(rùn)能力。在骨細(xì)胞、骨轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞上的整合素αvβ3上存在著骨唾液蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)二者結(jié)合效應(yīng)，在腫瘤細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

壯骨鎮(zhèn)痛膠囊對(duì)乳腺癌移植瘤骨轉(zhuǎn)移具有一定的防治作用，該膠囊對(duì)于裸鼠乳腺癌移植瘤組織中整合素αvβ3的表達(dá)起到顯著抑制作用，通過(guò)抑制裸鼠乳腺癌移植瘤組織中整合素αvβ3的表達(dá)，抑制裸鼠乳腺癌移植瘤細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)效應(yīng)，從而達(dá)到防治乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用。但其具體的作用機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究。

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（本文編輯徐愛(ài)良）

Effect of Zhuanggu Zhentong Capsule on the Expression of Integrin-αVβ3 in Breast Cancer Transplantable Tumor Naked Mouse Models

CAO Jianxiong1，F(xiàn)ENG Zhiwei2，HE Yingchun2，BI Sili2，WANG Wenmei2，HE Dan2，LIU Jinghong3*
（1.The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China；2.Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China；3.Department of Orthopedics and Traumatology，the First Affiliated Hospital of HUCM，Hunan，Changsha 410007，China）

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2015.02.005.014.04

2014-06-09

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（13JJ3103）；湖南省科技廳項(xiàng)目資助（2007TP4021）；湖南省科技廳項(xiàng)目資助（2010TT2020）；湖南省教育廳基金項(xiàng)目資助（09C724）。

曹建雄，男，博士，主任醫(yī)生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治腫瘤病。

*柳景紅，男，主任醫(yī)師，教授，E-mail：2274674521@qq.com。