基于PCR技術(shù)的研究基因差異表達的方法比較

卓微偉 張小蒙 李鳳 李艷萍 王毅兵

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院 江蘇鹽城 224005)

1 mRNA差異顯示技術(shù)

1.1 mRNA差異顯示技術(shù)的原理

mRNA差異顯示技術(shù)是Liang和Pardee于1992年首次提出的[1]。它的原理是:因為真核細胞mRNA 3'端具有poly(A)結(jié)構(gòu),人工合成poly(T)引物即錨定引物與之配對并進行反轉(zhuǎn)錄,然后用相同的錨定引物和隨機引物進行PCR擴增,用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物,對含有差異的片段進行回收,再次擴增后克隆測序,從而獲得cDNA,進而比較基因表達的差異。

1.2 mRNA差異顯示技術(shù)的優(yōu)點

所需實驗技術(shù)簡單,只運用了PCR和PAGE兩項基本的分子生物學(xué)技術(shù);需要初始RNA較少,因為低豐度的mRNA經(jīng)過PCR擴增以后將會變得很多;可同時比較多組不同mRNA樣品之間的基因差異表達情況;既可以分離在表達本質(zhì)上存在差異的基因,又可以分離在表達產(chǎn)量上存在差異的基因。

1.3 mRNA差異顯示技術(shù)的缺點

初始得到的差異片段較小,一般在300bp左右;得到的差異片段假陽性比較高,假陽性率高達70%;難以擴增低拷貝的mRNA,從而導(dǎo)致基因差異顯示出現(xiàn)誤差;由于3' 端引物的簡并性,使得某些差異條帶無法被擴增出來。得到的差異片段大多是3' 端非編碼序列,可供利用的信息較少;

2 抑制性差減雜交

2.1 抑制性差減雜交的原理

抑制性差減雜交由Diatchenkot首先提出。它以雜交動力學(xué)和抑制性PCR為原理,利用同樣條件下高豐度單鏈DNA分子與同源序列相配對的速度要大于低豐度單鏈DNA分子的特點,在試驗組和驅(qū)動組的cDNA變性后再復(fù)性的過程中,使材料中原來存在表達量上差異的基因在經(jīng)過PCR以后達到基本一致[2]。同時,由于試驗組的cDNA在進行雜交之前加有不同的接頭,當采用與兩個不同接頭序列互補的引物進行PCR擴增時,只有目標序列得到有效擴增,非目標序列退火時易產(chǎn)生類似“鍋柄”的結(jié)構(gòu),無法與引物配對,擴增受到抑制。

2.2 抑制性差減雜交的的優(yōu)點

操作相對簡單,過程也并不復(fù)雜,僅需要兩輪雜交且無需分離雜交過程中的復(fù)合體;該技術(shù)具有高度的靈敏性,即使豐度很低的片段也可以被檢測出來;可同時分析大量基因的差異表達,具有高通量的特點;該技術(shù)在待測cDNA的兩端加上了接頭引物,在PCR擴增中提高了特異性,減少了假陽性;

2.3 抑制性差減雜交的缺點

對于無酶切位點或酶切位點較少的片段無法檢測;無法檢測非酶切位點區(qū)域內(nèi)的突變、缺失或插入;起始樣品濃度要求過高,不適于來源困難的樣品;在SSH法的每一步驟完成后,均需對上一步驟進行驗證,以確保后續(xù)步驟的順利進行。

3 cDNA-AFLP

3.1 cDNA-AFLP的原理

cDNA-AFLP技術(shù)結(jié)合了DDRT-PCR和AFLP兩項技術(shù),其基本原理:以純化的mRNA為模板,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,用識別序列分別為6bp和4bp的兩種限制性內(nèi)切酶酶切cDNA,酶切片段用適宜的接頭進行連接,利用與接頭序列互補的引物進行預(yù)擴增和選擇性擴增,擴增產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示。

3.2 cDNA-AFLP的優(yōu)點

cDNA-AFLP具有較高的重復(fù)性;cDNA-AFLP對模板的質(zhì)量和反應(yīng)條件要求不高。

3.3 cDNA-AFLP的缺點

cDNA-AFLP依賴于cDNA上一個6bp的限制性酶切位點的存在。所以選擇的內(nèi)切酶應(yīng)該能最大可能地酶解cDNA樣品。理想的情況是每個cDNA樣品中都有一個識別位點為6bp的內(nèi)切酶的酶切位點,而在其一邊或兩邊恰好有一個4bp的酶切位點。

4 基因表達系列分析

4.1 基因表達系列分析的原理

基因表達系列分析是一種高通量研究功能基因組的方法。理論上來說一個9bp的短核苷酸序列能夠分辨262144個不同的轉(zhuǎn)錄物,所以理論上每一個9bp標簽?zāi)軌虼硪环N轉(zhuǎn)錄物的特征序列。因此考查這些小片段出現(xiàn)的頻率就可以知道每一種mRNA的豐度[3]。

4.2 基因表達系列分析的優(yōu)點

SAGE技術(shù)能夠全面收集基因表達信息,覆蓋面廣,并且對這些信息進行系統(tǒng)海量的分析。

4.3 基因表達系列分析的缺點

一些低豐度的mRNA可能包含不進來;SAGE技術(shù)依賴于一個能夠包含足夠信息的9bp的堿基序列在對標簽TAGs進行體外連接時可能會受到接頭的干擾而引起誤差。

5 結(jié)語

除了上述幾種主要的方法以外,還有一些常用的如代表性差異分析、RNA指紋圖譜技術(shù)、微陣列技術(shù)等新技術(shù)也在尋找分離新的基因中起到重要的作用。

另外,大量實踐證明,以上所述的分離差異表達基因的方法各有自己的特點,應(yīng)該根據(jù)研究材料的需要選擇最合適的方法,還可以根據(jù)實際的需要將多種方法進行融合,未來隨著各種技術(shù)的融合必將能建立一種能明確識別差異表達基因,且適合于檢測低豐度mRNA的方法。

[1]Liang P, Pardee A B. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction.Science, 1992, 257(5072): 967-971.

[2]Hubank M, Schatz D G.Identifying differences in mRNA expression by representional difference analysis of cDNA. Nucleic Acids Research,1994,22:5640-5648.

[3]Velculescu V E,Zhang L,Vogelstein B,Kinzler K W. Serial analysis of gene expression. Science,1995,270:484-487.

[4]張小芳,金梅.DDRT-PCR技術(shù)研究進展. 安徽農(nóng)學(xué)通報, 2008,14(20):29-30.

[5]高雪.差異表達基因分離技術(shù)的研究進展. 生物技術(shù)通報, 2009,6:71-74.