微小RNAs在破骨細(xì)胞分化調(diào)控中的研究進(jìn)展

連俊翔 杜瑋 孟姝

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院牙周病科（四川大學(xué)），成都 610041

牙槽骨是骨骼系統(tǒng)中代謝改建最活躍的部分，正常情況下其吸收與新生維持在平衡狀態(tài)。牙周炎可破壞牙槽骨的代謝穩(wěn)態(tài)，引起牙齒松動(dòng)和脫落。破骨細(xì)胞是體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞，在牙槽骨吸收過程中具有重要作用，其形成、增殖、分化及功能受多種細(xì)胞及其產(chǎn)物的調(diào)節(jié)[1]。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一組由22～25個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼單鏈RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、組織炎癥及腫瘤發(fā)生等過程。隨著miRNAs的發(fā)現(xiàn)，關(guān)于miRNAs參與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的功能愈來愈受到重視。目前已證實(shí)，miRNAs可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，直接或間接地影響破骨細(xì)胞的分化及功能[2]。

1 破骨細(xì)胞的主要調(diào)控途徑

在牙周炎癥組織中，成骨細(xì)胞和活化T淋巴細(xì)胞分泌的巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colonystimulating factor，M-CSF）和核因子-κB受體活化因子配基（receptor activator for nuclear factor kappa B ligand，RANKL）是直接參與破骨細(xì)胞分化的兩種細(xì)胞因子。M-CSF能誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞表達(dá)核因子-κB受體活化因子（receptor activator for nuclear factor kappa B，RANK），使其分化成為破骨細(xì)胞前體。某些促進(jìn)骨吸收的細(xì)胞因子，如前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1和IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等，均可刺激RANKL大量表達(dá)，促進(jìn)其與破骨細(xì)胞前體表面的RANK結(jié)合，誘導(dǎo)多核破骨細(xì)胞的分化成熟。某些骨保護(hù)因子，如降鈣素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）、IL-17等，介導(dǎo)產(chǎn)生的骨保護(hù)蛋白（osteoprotegerin，OPG）可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合RANKL，抑制破骨細(xì)胞分化成熟和骨吸收。RANK/RANKL/OPG信號(hào)通路是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的經(jīng)典途徑，已有大量研究關(guān)注破骨細(xì)胞分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，如c-Fos、活化T細(xì)胞核因子1蛋白（nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1）、核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）等[1]。此外，參與調(diào)控破骨細(xì)胞分化的信號(hào)途徑還有鈣離子通路，NF-κB通路，有絲分裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracelluar signal regulated kinase，ERK）途徑，JNK（Jun N-terminal kinase）途徑及鈣調(diào)磷酸酶/活化T細(xì)胞核因子通路等[3]。

2 促進(jìn)破骨細(xì)胞分化及功能活動(dòng)的miRNAs

由于破骨細(xì)胞分化和功能受多條信號(hào)通路調(diào)控，miRNAs可能通過抑制某些關(guān)鍵基因的表達(dá)調(diào)控破骨細(xì)胞分化和功能，在骨代謝疾病中發(fā)揮作用。miRNA-155、miRNA-146a、miRNA-181a和miRNA-223在骨關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMCs）的表達(dá)水平明顯高于健康人。在牙周炎小鼠的上頜骨中，miRNA-146a表達(dá)也顯著升高，同時(shí)TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的表達(dá)水平也明顯升高[4]。炎癥因子引發(fā)的持續(xù)性炎癥會(huì)介導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)，加重牙槽骨喪失[5]。以上miRNAs的高表達(dá)可能與骨破壞有關(guān)[6]。此外，在牙周炎患者的牙齦組織中，發(fā)現(xiàn)miRNA-146、miRNA-451、miRNA-223、miRNA-486-5p、miRNA-3917有明顯的高表達(dá)[7-8]，提示這些miRNAs可能與牙周炎的炎癥發(fā)生及牙槽骨破壞有關(guān)。

在Dicer基因敲除的骨髓源巨噬細(xì)胞（bone marrow-derived macrophages，BMMs）中，miRNA-155的表達(dá)被抑制，src同源2肌醇5'磷酸酶（src homology 2 domain-containing inositol-5-phosphatase，SHIP）的表達(dá)水平升高，破骨細(xì)胞形成顯著減少[9]。miRNA-155的靶基因SHIP能抑制破骨細(xì)胞分化，還可抑制多條炎癥通路。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜和滑膜液中檢測(cè)到miRNA-155高表達(dá)，miRNA-155通過抑制SHIP-1的表達(dá)而促進(jìn)炎癥反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[10]。在miRNA-155基因敲除的關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)，破骨細(xì)胞明顯減少，骨吸收活動(dòng)減弱，而miRNA-155基因敲除的BMMs的破骨細(xì)胞向分化也被抑制，但破骨細(xì)胞前體數(shù)量與對(duì)照組并無(wú)明顯變化，提示miRNA-155可能促進(jìn)破骨細(xì)胞前體分化為成熟破骨細(xì)胞[11]。然而，關(guān)于miRNA-155在破骨細(xì)胞分化中的作用仍存在爭(zhēng)議。研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞分化中加入干擾素-β可誘導(dǎo)miRNA-155的表達(dá)，miRNA-155能抑制破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵因子細(xì)胞因子信號(hào)傳遞抑制蛋白1（suppressor of cytokine signaling1，SOCS1）和色素形成相關(guān)蛋白小眼球相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF），從而抑制破骨細(xì)胞分化。同時(shí)，miRNA-155還參與調(diào)控成骨細(xì)胞的分化過程。miRNA-155基因敲除的MC3T3-E1細(xì)胞中靶基因SOCS1表達(dá)增強(qiáng)，抑制TNF-α激活的JNK信號(hào)通路，使成骨明顯減少。Xie等[13]發(fā)現(xiàn)，hsa-miRNA-155在牙周炎患者牙齦中的表達(dá)明顯低于牙周健康組，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的情況不一致，可能是由于牙齦細(xì)胞成分的多樣化增加了miRNAs調(diào)控的復(fù)雜性。盡管牙周炎與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎均表現(xiàn)為以炎癥反應(yīng)為主伴隨破骨活動(dòng)增強(qiáng)的疾病，但miRNA-155在牙周炎的炎癥反應(yīng)及骨破壞過程中的調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

miRNA-21在BMMs破骨細(xì)胞向分化中高表達(dá)，抑制其靶基因程序性細(xì)胞死亡蛋白4（programmed cell death 4，PDCD4）的表達(dá)，解除PDCD4對(duì)c-fos的抑制，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。c-fos是破骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，也是破骨細(xì)胞特異的下游靶基因，c-fos基因敲除的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)骨硬化癥[14-16]。miRNA-21的表達(dá)水平與c-fos呈正相關(guān)關(guān)系，miRNA-21表達(dá)水平在c-fos缺乏的BMMs中隨之下降，提示miRNA-21/PDCD4/c-fos所形成的正反饋效應(yīng)環(huán)在促進(jìn)破骨細(xì)胞產(chǎn)生及分化中發(fā)揮調(diào)控作用[17]。

在BMMs細(xì)胞中，miRNA-223的表達(dá)可被PU.1激活，抑制靶基因核因子I-A，從而增強(qiáng)M-CSF受體（M-CSF receptor，M-CSFR）的表達(dá)，同時(shí)施加正反饋?zhàn)饔糜谵D(zhuǎn)錄因子如PU.1和c-fos，形成M-CSF/PU.1/miRNA-223/M-CSFR正反饋效應(yīng)環(huán)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[18]。但Sugatani等[19]發(fā)現(xiàn)，RAW264.7細(xì)胞中pre-miRNA-223高表達(dá)可完全阻斷破骨細(xì)胞形成，并且miRNA-223在破骨細(xì)胞中的表達(dá)水平較在BMMs中低。Shibuya等[20]發(fā)現(xiàn)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中miRNA-223表達(dá)升高，尤其是在急性重度滑膜炎和伴有骨破壞的患者；但在體外共培養(yǎng)體系中，miRNA-223過表達(dá)卻使破骨細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)miRNA-223劑量依賴性減少，miRNA-146也具有與miRNA-223類似的現(xiàn)象，二者均在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的滑膜中高表達(dá)，并且其過表達(dá)能降低炎癥因子和破骨細(xì)胞的生成，成為炎癥和破骨細(xì)胞生成的負(fù)向調(diào)控因子；這提示在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，miRNA-223和miRNA-146在調(diào)控破骨細(xì)胞發(fā)生時(shí)需要適宜的表達(dá)量[20-22]。

Cheng等[23]發(fā)現(xiàn)，RANKL和M-CSF刺激的CD14和PBMCs中miRNA-148表達(dá)升高，抑制V-maf肌纖維肉瘤同源癌基因B的表達(dá)，減弱其抑制破骨細(xì)胞分化的作用。在卵巢切除小鼠體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)，抑制miRNA-148a表達(dá)可顯著增加小鼠骨密度。此外，miRNA-9718可抑制活化的STAT3蛋白抑制劑（protein inhibitor of activated STAT3，PIAS3）的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，在miRNA-9718基因沉默的卵巢切除小鼠體內(nèi)骨吸收活動(dòng)被抑制，骨量增加[24]。

miRNAs差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，miRNA-31在破骨細(xì)胞中的表達(dá)水平較BMMs升高了18倍，miRNA-31的靶基因RhoA是肌動(dòng)蛋白和細(xì)胞骨架微管轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)的重要分子開關(guān)，miRNA-31抑制能引起RhoA蛋白水平升高，導(dǎo)致破骨細(xì)胞外周肌動(dòng)蛋白環(huán)形成受損，抑制破骨細(xì)胞形成和骨吸收活動(dòng)[25]。

有學(xué)者[26-27]將白人女性骨質(zhì)疏松患者分為高骨密度組與低骨密度組，對(duì)比兩組患者PBMCs的miRNAs表達(dá)差異，先后發(fā)現(xiàn)miRNA-133a和miRNA-422a在低骨密度組中升高；miRNA-133a和miRNA-422a與其靶基因具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miRNA-133a還參與調(diào)控成骨細(xì)胞的分化[26,28-29]，在抗骨質(zhì)疏松藥物伊班膦酸鹽作用下，人牙周膜干細(xì)胞中的miRNA-133a表達(dá)升高[26,30]，而牙周膜干細(xì)胞是成骨細(xì)胞前體的重要來源[31]，miRNA-133a的高表達(dá)可能與抑制人牙周膜干細(xì)胞成骨向分化有關(guān)。

3 抑制破骨細(xì)胞分化及功能活動(dòng)的miRNAs

Guo等[32]通過研究證實(shí)，在PBMCs破骨細(xì)胞向分化過程中miRNA-125a表達(dá)降低，而miRNA-125a過表達(dá)能抑制破骨細(xì)胞分化和抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）及NFATc1的表達(dá)。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）是miRNA-125a的靶基因，是維持破骨細(xì)胞的細(xì)胞骨架和骨吸收活動(dòng)的關(guān)鍵因子。NFATc1與miRNA-125a的啟動(dòng)子結(jié)合抑制其表達(dá)，形成miRNA-125a/TRAF6/NFATc1負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)。NFATc1是破骨細(xì)胞分化中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可通過與破骨細(xì)胞特異基因啟動(dòng)子結(jié)合，如TRAP、組織蛋白酶K、降鈣素受體、整合素β3等發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[32]。NFATc1基因敲除的小鼠可出現(xiàn)嚴(yán)重的骨硬化癥，破骨細(xì)胞數(shù)量顯著減少，骨吸收功能明顯降低[33-34]。Nakasa等[35]發(fā)現(xiàn)，miRNA-146a能通過抑制TRAF6而下調(diào)c-Jun、NFATc1、PU.1及TRAP的表達(dá)，從而抑制PBMCs向破骨細(xì)胞分化；而對(duì)關(guān)節(jié)炎小鼠靜脈注射miRNA-146a能抑制關(guān)節(jié)骨破壞。miRNA-146a/b可結(jié)合至TRAF6和IL-1受體相關(guān)激酶1（IL-1 receptor associated kinase 1，IRAK1）mRNA的3'端非翻譯區(qū)，抑制其蛋白表達(dá)，從而調(diào)控IRAK1和TRAF6參與的免疫反應(yīng)和破骨細(xì)胞分化過程[36]。

在絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥患者的PBMCs中miRNA-503表達(dá)顯著降低，而miRNA-503過表達(dá)可抑制PBMCs破骨細(xì)胞向分化，RANK是其靶基因。在卵巢切除小鼠中沉默miRNA-503可上調(diào)RANK蛋白表達(dá)，促進(jìn)骨吸收，而過表達(dá)miRNA-503則能抑制卵巢切除小鼠的骨吸收，提示miRNA-503在絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展中具有重要作用[37]。

Rossi等[38]發(fā)現(xiàn)，miRNA-29b在人破骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)下降，在破骨細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-29b使TRAP、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、cathepsin K及NFATc1蛋白水平下調(diào)，并破壞肌動(dòng)蛋白環(huán)的形成。miRNA-29b通過抑制其靶基因c-fos和基質(zhì)金屬蛋白酶-2的表達(dá)調(diào)控破骨細(xì)胞分化和骨吸收活動(dòng)。而Franceschetti等[2]的研究結(jié)果與之相反，他們發(fā)現(xiàn)miRNA-29a/b/c在破骨細(xì)胞分化過程中表達(dá)升高，而miRNA-29基因敲除則破壞破骨細(xì)胞分化及其前體遷移。兩者研究結(jié)果的差異可能是由于選用了不同的細(xì)胞所致，前者選用的是人成熟破骨細(xì)胞，而后者使用的小鼠骨髓細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞系是具有分化潛能的前體細(xì)胞。miRNA-29對(duì)破骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

miRNA-124在RANKL誘導(dǎo)的BMMs破骨細(xì)胞分化中表達(dá)降低，pre-miRNA-124轉(zhuǎn)染BMMs后，NFATc1表達(dá)顯著下調(diào)，抑制破骨細(xì)胞向形成，破骨細(xì)胞前體遷移活動(dòng)顯著減少，但不影響NFATc1的上游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，如NF-κB p65和c-Fos。進(jìn)一步研究[39]發(fā)現(xiàn)，NFATc1過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)miRNA-124的抑制作用，同時(shí)抑制miRNA-124可以顯著促進(jìn)依賴NFATc1的TRAP和Cathepsin K的基因表達(dá)，提示miRNA-124通過抑制靶基因NFATc1的表達(dá)來調(diào)控破骨細(xì)胞的分化。

miRNA-26a在破骨細(xì)胞發(fā)生的晚期上調(diào)，直接影響結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）/CCN家族2（CCN family 2，CCN2）的表達(dá)水平，而CTGF/CCN2能上調(diào)樹突狀細(xì)胞特異性跨膜蛋白（dendritic cell-specific transmembrane protein，DC-STAMP）而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化。在破骨細(xì)胞前體中表達(dá)miRNA-26a能夠抑制破骨細(xì)胞分化，肌動(dòng)蛋白環(huán)形成和骨吸收。miRNA-26a抑制劑能上調(diào)CTGF的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成并增強(qiáng)其功能[40]。

4 發(fā)展與展望

牙周炎是成年人失牙的最主要原因，現(xiàn)有治療手段對(duì)牙周炎骨喪失的治療效果并不理想。牙周基礎(chǔ)治療僅能控制或減緩骨吸收，引導(dǎo)組織再生術(shù)和引導(dǎo)骨組織再生術(shù)等手術(shù)治療也存在適應(yīng)證選擇的局限。有研究采用炎癥細(xì)胞因子拮抗劑或誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡的方法來抑制骨吸收，但由于該方法可能導(dǎo)致頜骨壞死、腎衰竭等嚴(yán)重不良反應(yīng)而導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受到限制。與破骨細(xì)胞相關(guān)miRNAs的發(fā)現(xiàn)使miRNAs成為調(diào)控破骨細(xì)胞分化與功能的新靶點(diǎn)，為治療破骨細(xì)胞主導(dǎo)的骨代謝疾病開辟了新思路。但是，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作為非編碼RNA的另一重要成員，因其多數(shù)結(jié)構(gòu)與mRNA有一定相似性，所以可以作為一種競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA與miRNAs相互作用，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控[41]。綜上所述，單個(gè)miRNA的調(diào)控作用相對(duì)有限，進(jìn)一步研究需綜合考慮多個(gè)miRNAs之間的相互作用關(guān)系，及其在基因水平的精細(xì)調(diào)控作用。將來，miRNAs的研究成果有望與傳統(tǒng)的牙周基礎(chǔ)治療和再生手術(shù)治療相結(jié)合，共同發(fā)揮優(yōu)勢(shì)，為臨床預(yù)防和治療牙周炎導(dǎo)致的牙槽骨吸收提供新的方法。

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